一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法技术

本发明专利技术公开了一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法。一种用于高通量单细胞测序的分子标记微珠，包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，所述寡核苷酸链包括：通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；多聚T尾，与mRNA的poly A序列结合；分子标签序列，标识结合的mRNA；细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞。本发明专利技术分子标记微珠的分子标记序列分为4个功能区，分别为通用引物序列、细胞标签序列、分子标签序列和多聚T尾，基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法能够一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息，且整套实验成本低、时间短、通量高，具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法。
技术介绍
传统的流式细胞分析能快速对成千上万个细胞进行多参数的定量分析。流式荧光分选是通过表面抗原或者荧光标记对需要分选的大量细胞进行预处理，可以灵活的根据需要的参数分选出需要的细胞亚群。经过改造的流式荧光分选系统，将细胞密度稀释控制的话还能完成单细胞分析。不过流式仪器的仪器，各类抗原成本较高，功能虽然强大，但主要还是进行大量细胞定量分群分析。某些珍贵的样品则很难达到流式分析细胞数量要求，比如早期的胚胎干细胞，来自病人肿瘤组织的样本或特殊的血样，细胞数目可能并没有那么多，单细胞测序分析的实验技术思路也逐步为人们接受，扩增单个细胞中转录组，基因组的方法逐渐成熟。进行单细胞测序更加方便，另一方面，细胞间的异质性表明每一个细胞都是完全不相同的，包括干细胞，肿瘤细胞等等，不同组织中干细胞类群的定义也不明晰，比如造血系统干细胞和间充质干细胞。异质性在这些组织中是相当明显但并未被完全解释的。没有两个细胞的基因组，转录组水平上市完全类似的，因此对大量细胞的平均组学表达分析会平均掉本来在单个细胞中相当显著的表达特征，相应的，大量细胞的群体分析很有可能是我们丧失了发现一些罕见的细胞亚群的机会，因此单细胞测序这一工具在胚胎，肿瘤，各类干细胞研究中都具有无法比拟的优势。随着单细胞测序技术的不断突破和测序仪器的广泛使用，使单细胞测序分析越来越多的应用到各类前沿生物医学研究中。以往进行的传统单细胞测序分析是靠手工挑取单细胞，受限于人力分析的细胞数量是有限的，提高分析的细胞数量就能从大量数据中发掘更多有效信息，目前国内尚无通量较高的单细胞测序分析平台与相关技术，而国外2015年发表文章提到用微孔板分离细胞PCR后检测少量基因表达，使用这个技术仅能同时检测81个基因的表达情况，通量极低，并且成本高，应用不广。国外有基于微流控技术，使用微流体制造的连续不断的液滴在微通道中包裹单细胞进行单细胞分离，能达到较高的通量，同时使用带有标记的微珠结合单个细胞内的mRNA加以标记，代表性的有哈佛大学医学院发表在《Cell》期刊中的Drop-seq与InDrop技术，两者均是基于微流体技术的单细胞分离方法，能达到比较高的通量。除此以外，其他手工挑取，机器与流式技术改造的单细胞分选都达不到高通量单细胞测序分析的要求。
技术实现思路
本专利技术提供了一种分子标记微珠及基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法，该高通量单细胞测序方法能够一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息。一种用于高通量单细胞测序的分子标记微珠，包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，其特征在于，所述寡核苷酸链包括：通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；多聚T尾，与mRNA的polyA序列结合；分子标签序列，标识结合的mRNA；细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞。每个分子标记微珠上均结合有大量的作为分子标记的寡核苷酸链。优选的，所述微珠本体为磁珠。一般如果是普通的微珠而不是磁珠的话，在纯化和洗涤时，需要通过重力方式来对分子标记微珠进行分离，比如自然沉降或者离心。而使用磁珠的话，可以直接使用磁力架进行分离，比较方便，且速度更快。优选的，所述微珠本体的直径为15～25μm。使用时，需要一个微珠与一个细胞进行结合，所以微珠的大小与所检测的细胞大小接近为宜。优选的，所述微珠与分子标记偶联方式为：分子标记5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基，微珠表面修饰有羧基，羧基与所述胺基缩合。由于分子标记为单链寡核苷酸，其5’端的第一个核苷酸上的羟基用胺基取代，微珠表面修饰羧基，通过胺基与羧基的反应，将分子标记偶联到微珠上。优选的，所述分子标签序列至少部分为随机合成。优选的，所述细胞标签序列由多个特异性片段串接组成，不同位置的特异性片段选自相同的或不同的特异性片段库，所述细胞标签序列利用所述特异性片段的排列组合方式不同标识细胞。优选的，所述分子标记微珠的制备方法，包括以下步骤：(1)合成通用引物序列，所述通用引物序列3’端连接细胞标签序列的其中一个特异性片段；(2)将通用引物序列与微珠本体偶联，获得偶联物；(3)通过PCR延伸在偶联物3’端串接细胞标签序列的其余特异性片段，组装形成细胞标签序列；(4)在细胞标签序列3’端依次连接分子标签序列和多聚T尾。本专利技术又提供了一种高通量单细胞测序方法，所述步骤为：(1)将细胞加入到微孔板中，然后加入所述的分子标记微珠，其中微孔板上的微孔直径大小为刚好容纳一个细胞和一个分子标记微珠；(2)加入裂解液，孵育；(3)收集分子标记微珠-mRNA复合物，进行逆转录PCR，获得带有所述分子标记的cDNA；(4)构建测序文库，进行高通量测序。分子标记微珠的细胞标签序列，单个分子标记微珠上的所有分子标记均具有相同细胞标签序列，而不同分子标记微珠间的分子标记的细胞标签序列均不同，所以可以在最后得到的测序数据中区分哪些序列是来自于同一个细胞，哪些序列来自于不同的细胞。分子标签序列，单个分子标记微珠上的所有分子标记均具有不同分子标签序列，分子标签序列只负责单个分子标记微珠上的所有分子标签序列不同，而不管不同细胞之间的分子标签序列，合成时是由若干个随机合成的核苷酸组成，对于单个细胞来说，可以使得每一条mRNA结合的分子标签序列可以由分子标签序列来区分，对于最后得到的测序数据来说，可以在用细胞标签序列区分了不同细胞后，再根据分子标签序列的差异区分哪些是真实的细胞内表达差异造成的mRNA拷贝数存在差异，而哪些是由同一条mRNA经过PCR扩增得来，由PCR扩增造成的拷贝数差异需要在数据处理时，进行矫正。为了保证获得单个的细胞，优选的，细胞加入微孔板中的落孔率控制在8％～12％。落孔率过大不利于获得一个孔中只有一个细胞。而为了尽量使所有细胞都能够结合一个分子标记微珠，优选的，分子标记微珠加入微孔板中的落孔率大于99％。如果分子标记微珠的落孔率太小，则容易造成部分细胞结合不到分子标记微珠，相当于最终结果中缺少部分细胞的数据，这样不利于反映待检测细胞整体的情况。优选的，所述微孔板制备方法为：(1)在硅片上刻蚀出微孔作为初始模具，微孔直径20～50μm；(2)在初始模具上浇注聚二甲基硅氧烷(PDMS)，成型后取下成为带有微柱的反向模具；(3)在反向模具上浇注加热融化的浓度为4％～6％的琼脂糖，冷却成型后，取下即为微孔板。本专利技术分子标记微珠的分子标记序列分为4个功能区，分别为通用引物序列、细胞标签序列、分子标签序列和多聚T尾，基于该分子标记微珠的高通量单细胞测序方法能够一次性获得上万个单细胞的特异性转录组信息，且整套实验成本低、时间短、通量高，具有很好的应用价值。附图说明图1为微孔板示意图；图2为分子标记磁珠制备流程图；图3为分子标记微珠性能检测结果图，其中图A为单个分子标记微珠上分子标记数检测结果图，图B为分子标记微珠均一性检测结果图，共检测6个分子标记微珠；图4为分子标记微珠结合mRNA能力检测时的凝胶电泳图；图5为制备的cDNA测序文库片段大小分布图；图6为实施例2中人鼠混合细胞分群对比图；图7为实施例3中CD34+细胞基因表达差异热图图8为实施例3中CD34+细胞tSNE分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于高通量单细胞测序的分子标记微珠，包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，其特征在于，所述寡核苷酸链包括：通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；多聚T尾，与mRNA的poly A序列结合；分子标签序列，标识结合的mRNA；细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞。

【技术特征摘要】
1.一种用于高通量单细胞测序的分子标记微珠，包括微珠本体和偶联的作为分子标记的寡核苷酸链，其特征在于，所述寡核苷酸链包括：通用引物序列，作为PCR扩增时的引物结合区域；多聚T尾，与mRNA的polyA序列结合；分子标签序列，标识结合的mRNA；细胞标签序列，标识mRNA取自的细胞。2.如权利要求1所述的分子标记微珠，其特征在于，所述微珠本体为磁珠。3.如权利要求1所述的分子标记微珠，其特征在于，所述微珠本体的直径为15～25μm。4.如权利要求1所述的分子标记微珠，其特征在于，所述分子标签序列至少部分为随机合成。5.如权利要求1所述的分子标记微珠，其特征在于，所述细胞标签序列由多个特异性片段串接组成，不同位置的特异性片段选自相同的或不同的特异性片段库，所述细胞标签序列利用所述特异性片段的排列组合方式不同标识细胞。6.如权利要求5所述分子标记微珠的制备方法，包括以下步骤：(1)合成通用引物序列，所述通用引物序列3’端连接细胞标签序列的其中一个特异性片段；(2)将通用引物序列与微珠本体偶联，获得偶联物；(3)通过PCR延伸在...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭国骥，赖淑静，叶昉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33