本发明专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法。所述引物包括52对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：104所示；所述试剂盒还包括所述特异性引物、通用引物、酶混合物、质控品、无核酸酶水。本发明专利技术还公开了运用所述引物或试剂盒用一次PCR扩增反应捕获和扩增遗传性耳聋基因的检测方法。本发明专利技术方案有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤。
【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及方法
本专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
耳聋属于临床常见出生缺陷，在中国，听力语言残疾患者超过2700万，居各类残疾之首。在新生儿群体中，先天性听力障碍的发生率高达1-3/1000，据估算，我国每年新增3-6万耳聋患者，而这些耳聋残疾约60％由遗传因素引起的。遗传性耳聋基因检测是通过检测受检者耳聋致病基因情况，指导耳聋患者或高风险人群的干预和治疗，同时通过对耳聋基因检测结果的分析，确定遗传方式，对患者家庭成员的患病风险，基因携带风险，子代患病风险等作出科学评估，指导科学婚育，从源头上预防耳聋出生缺陷。目前检测耳聋遗传病基因常见方法有Sanger法、基因芯片法、荧光定量PCR法、多色荧光溶解曲线分析法、高通量测序法等。Sanger测序法测序每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，检测效率低、成本高，且灵敏度低(20％)。基因芯片法、荧光定量PCR法检测耳聋遗传病基因，该方法只能针对一个或数个已知突变的位点设计检测探针形成检测芯片，因此无法用于检测未知突变位点，检测的结果也就不够全面、准确。多色荧光溶解曲线分析法，所用的荧光染料是通用的双链DNA嵌入剂，对引物二聚体和非特异扩增产物无法识别，容易造成假阳性。高通量测序法主要是由测序仪器提供商提供的测序仪配套文库构建试剂盒，经过了供应公司严格的质控评估，具有较好的建库效果，但缺点是试剂盒货期长、试剂盒包装规格固定、试验灵活性不够等。一些试剂厂商根据文献中分享报道的实验方法进行建库，但所完成的实验效果参差不齐，测序质量不高，影响临床参考价值。目前，市面上检测耳聋基因主流为GJB2(基因突变临床表现为先天性重度耳聋)、GJB3(基因突变临床表现为后天高频感音神经性耳聋)、SLC26A4(基因突变临床表现为先天性或迟发型耳聋)、MT-RNR1(基因突变临床表现为药物性耳聋，携带基因突变的个体对氨基糖苷类药物敏感，就是常说的“一针致聋”)4个常见遗传性耳聋基因，且检测多以位点筛查为主，检测的基因突变信息少，不足以反映遗传性耳聋的突变整体情况。由此可见，现有技术还有待改进。
技术实现思路
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物、试剂盒及检测方法。所述引物覆盖GJB2、GJB3、SLC26A4、MT-RNR1、FOXI1、KCNJ10六种基因全外显子中所有常见与罕见的突变位点；能够同时检测多个样本多个遗传性耳聋易感基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的多重PCR特异性引物，包括52对特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：104所示。进一步的，所述特异性引物为经过修饰的引物。进一步的，所述特异性引物的修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。进一步的，所述特异性引物的Tm值为58-62℃。一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的试剂盒，包括上述引物中的至少两对。进一步的，所述试剂盒还包括通用引物、酶混合物、质控品、无核酸酶水；所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物等。进一步的，所述质控品为人正常基因组DNA，来源于市售。进一步的，所述特异性引物3’端和5’端分别标记Tag1和Tag2。进一步的，所述特异性引物3’端Tag1序列与目标区域完全互补或部分互补；特异性引物5’端Tag2与通用引物完全互补或部分互补。进一步的，所述通用引物用于对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。进一步的，所述通用引物3’端Tag3与特异引物Tag2完全互补或部分互补，长度为50-70bp。进一步的，所述特异性引物或试剂盒应用于遗传性耳聋致病基因检测。基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的方法，包括：S1：使用磁珠法对样本进行核酸提取，然后进行浓度及纯度的测定，测定合格后进行定量稀释，备用；S2：用含所述特异性引物的反应体系或所述试剂盒对S1中所提取的核酸的目标区域进行一次PCR扩增，收集扩增产物备用；S3：使用磁珠法对S2中扩增产物进行核酸纯化，进行浓度及纯度的测定，混样，定量，上机测序。进一步的，含所述特异性引物的反应体系为：所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶、PCRBuffer、dNTP混合物等。进一步的，所述PCR扩增的反应程序为：进一步的，所述遗传性耳聋致病基因包括FOXI1(引物序列SEQIDNO:1-SEQIDNO:10)、KCNJ10(引物序列SEQIDNO:11-SEQIDNO:34)、SLC26A4(引物序列SEQIDNO:35-SEQIDNO:78)、GJB2(引物序列SEQIDNO:79-SEQIDNO:90)、GJB3(引物序列SEQIDNO:91-SEQIDNO:100)、MT-RNR1(引物序列SEQIDNO:101-SEQIDNO:104)六个基因。进一步的，步骤(2)中所述的核酸的目标区域，包括但不限于GJB2、GJB3、SLC26A4、MT-RNR1、FOXI1、KCNJ10六个基因上的内部序列、基因的外部调控序列；所述基因内部序列，包括但不限于基因的内含子区域、外显子区域、同时含有内含子与外显子的区域。进一步的，所述检测方法的检测样本包括离体的全血、口腔脱落细胞和组织样品等；所述组织样品包括石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片等。上述高通量测序平台包含但不限于IlluminaHiSeq/MiSeq、Life的IonTorrent/Proton平台、华大基因的BGISEQ-500/50等测序平台。本专利技术有益效果：本专利技术提供的基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重PCR特异性引物，检测基因范围除了常见的GJB2、GJB3、SLC26A4、MT-RNR1基因全部外显子检测，还包括其它耳聋致病基因相关基因FOXI1(叉头转录因子家族)、KCNJ10(内向整流型钾通道家族)基因全部外显子检测，覆盖上述六种基因所有常见与罕见得突变位点；能够同时检测多个样本、多个遗传性耳聋易感基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低成本、简化操作步骤等。本专利技术提供的引物是针对遗传性耳聋致病基因GJB2、GJB3、SLC26A4、MT-RNR1、FOXI1、KCNJ10的全外显子设计的引物，覆盖范围广、检测位点多。每对特异性引物扩增目标区域大小为450-550bp，所有引物Tm值统一设计为58-62℃。本专利技术提供的多重PCR引物设计时引进修饰，比如硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰等修饰方法，修饰后的引物不易被核酸酶降解，确保PCR扩增特异性的同时保证其扩增效率；且具有相对均一的Tm值，在多重扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，同时不存在非特异扩增，此方法省去多轮引物筛选的工作。具体的，硫代修饰后的引物序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，能够抵抗核酸酶的降解，增强引物稳定性；脱氧尿嘧啶修饰后的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的多重PCR特异性引物，其特征在于，所述多重PCR特异性引物包括52对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：104所示。
【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的多重PCR特异性引物，其特征在于，所述多重PCR特异性引物包括52对特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1至SEQIDNO：104所示。2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物为经过修饰的引物。3.根据权利要求2所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的Tm值为58-62℃。5.一种基于高通量测序技术检测遗传性耳聋致病基因的试剂盒，其特征在于，包括上述权利要求1-4任一项所述的特异性引物中的至少两对。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括通用引物、酶混合物、质控品、无核酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱奇，朱瑞娟，关媛妹，罗李江，刘丽，
申请(专利权)人：广州奇辉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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