一种产脂肪烃基因的高通量筛选方法及获得的突变体与应用技术

本发明专利技术公开了一种产脂肪烃基因的高通量筛选方法及获得的突变体与应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术所提供的方法是将携带潜在产脂肪烃基因的载体导入到携带有检测元件的宿主细胞中，培养宿主细胞，通过对检测元件信号响应鉴别目的基因的表达情况，并分离高产脂肪烃的突变体。同时，本发明专利技术还提供了利用所述筛选方法获得的脂肪醛脱甲酰加氧酶突变体。本发明专利技术提供的脂肪醛脱甲酰加氧酶突变体具有较该酶野生型具有更高的脂肪烃合成效率。本发明专利技术提供的高产脂肪烃基因的高通量筛选方法有助于快速的从具有潜在产烃能力的备选基因及其突变体文库中筛选出具有更高产烃效率的特定基因或突变体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种产脂肪烃基因的高通量筛选方法及获得的突变体与应用，属于生物工程

技术介绍
发展生物燃料是解决人类所面临的资源、能源与环境等方面问题的有效途径之一。由于脂肪烃是汽油、柴油、航空煤油等发动机燃料的主要成分，具有高能量密度、低吸湿性与低挥发性，并且与现有运输设施及发动机系统相匹配，生物脂肪烃已经被认为是一种最有潜力的优质生物燃料。近年来，在一些生物体中陆续发现，某些特定的酶能够将细胞内的脂肪族化合物(如脂肪酸、脂肪醛)转化为脂肪烃。例如，在蓝细菌中主要存在一条两步法合成脂肪烃的途径，即脂酰ACP在脂酰ACP还原酶(AAR)作用下生成脂肪醛，脂肪醛再经脂肪醛脱甲酰加氧酶(ADO)催化脱甲酰基生成脂肪烃和甲酸。此外，在Jeotgalicoccus菌中存在一种细胞色素P450OleT，它能够直接将脂肪酸脱羧基生成具有末端不饱和双键的烯烃。目前上述途径均已实现在大肠杆菌或蓝细菌中重组表达，且成功检测到C15、C17、C19等脂肪烃的合成，表现出较好的发展前景。目前一些具有天然脂肪烃生物合成途径的微生物合成脂肪烃的效率都很低，并不具备工业应用潜力，一个关键原因在于催化剂极低的催化效率。因此，通过生物工程技术手段提高上述脂肪烃合成途径中关键酶的催化活性，是促进脂肪烃生物合成的有效途径之一。例如通过向酶的一级结构中随机或半随机地引入单个或数个氨基酸的插入、删除或替换，通过相应的高通量筛选方法，是改变酶的催化特性，实现酶的改良的一种有效手段。由于潜在可选的改造方案众多，如何通过高通量筛选手段快速分离出产烃能力强的酶或突变株，是目前亟待解决的问题。然而，受脂肪烃自身的物理化学性质限制，如何快速评价微生物合成脂肪烃的能力是研究工作中的难点。传统的技术流程是首先通过有机溶剂将细胞中的脂肪烃抽提和浓缩，然后通过气相色谱-质谱联用技术分析其中脂肪烃组分的含量，分析过程通量低，所需时间长，分析成本较高(SchirmerA,etal,Science,2010.329:559-562)。受分析方法的限制，目前尚无针对产脂肪烃基因的高通量筛选方法的实施先例。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种产脂肪烃基因的高通量筛选方法及获得的突变体与应用，所采取的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种产脂肪烃基因的高通量筛选方法，该方法是将携带潜在产脂肪烃基因的载体导入到携带有检测元件的宿主细胞中，培养宿主细胞，通过对检测元件信号响应鉴别目的基因的表达情况，并分离高产脂肪烃的突变体。所述筛选方法的步骤如下：1)扩增产脂肪烃基因，并通过易错PCR反应引入随机突变，获得扩增产物；2)将步骤1)获得的扩增产物经酶切后连接到含有抗性基因的质粒载体中，获得重组质粒；3)构建携带检测元件的宿主细胞，并将步骤2)所得的重组质粒转化至宿主细胞，获得转化子；4)培养步骤3)所得转化子，检测并根据对检测元件的信号响应进行目的基因表达的鉴定并分离高产脂肪烃的突变体。优选地，步骤1)所述产脂肪烃基因，是脂肪醛脱甲酰加氧酶基因ADO。优选地，步骤3)所述检测元件，包括脂肪烃检测元件和报告元件。更优选地，所述脂肪烃检测元件，至少包含一个组成型启动子、一个转录激活因子和一个烃响应特性启动子；所述报告元件，是绿色荧光蛋白、LacZ基因、荧光素酶或抗性基因中的一种。优选地，所述组成型启动子为启动子PalkS，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述转录激活因子，为转录激活因子AlkR，氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；所述烃响应特性启动子，是启动子PalkM，核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。优选地，步骤3)所述宿主细胞，是大肠杆菌、酵母或蓝细菌。优选地，步骤4)所述检测元件的信号，是指荧光强度、光吸收值、化学发光强度和菌落大小中的一种或几种。所述任一筛选方法在高产脂肪烃基因工程菌中的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述筛选方法获得的突变体，该突变体如SEQIDNO.1所示的脂肪醛脱甲酰加氧酶的氨基酸序列至少发生以下一种变化：1)第194位谷氨酸突变为亮氨酸(E194K)，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；2)第9位谷氨酸突变为甘氨酸，且第27位异亮氨酸突变为天冬酰胺(I9G&I27N)，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；3)第204位谷氨酸突变为苯丙氨酸(I204F)，其氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。所述突变体在脂肪烃生物合成中的应用也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术获得的有益效果是：利用本专利技术提供的筛选方法获得的脂肪醛脱甲酰加氧酶突变体具有较该酶野生型具有更高的脂肪烃合成效率；本专利技术提供的高产脂肪烃基因的高通量筛选方法有助于快速的从具有潜在产烃能力的备选基因及其突变体文库中筛选出具有更高产烃效率的特定基因或突变体；具体地：1)本专利技术所述脂肪醛脱甲酰加氧酶突变基因的突变位点在本专利技术之前无公开报道。2)本专利技术所述高通量筛选方法利用脂肪烃检测元件在细胞中直接检测脂肪烃的合成情况，可根据报告蛋白的信号强度(如荧光、化学发光、酶活等)，首次实现从较大的基因文库中快速筛选出具有产烃能力以及产烃能力更强的特定基因及其突变体，此前尚无其他类似的针对产脂肪烃基因的高通量筛选方法的报道。附图说明图1携带AAR-ADO产烃基因的质粒1示意图。图2大肠杆菌中的脂肪烃的GC-MS检测结果。其中，图A为对照样品，图B为产脂肪烃的大肠杆菌样品，内标物为正二十烷，主要脂肪烃产物为正十五烷与十七烯。图3携带脂肪烃检测元件的质粒2示意图。图4菌液荧光强度随诱导剂浓度和培养时间的变化及脂肪烃含量与荧光强度的关系；其中，图A为菌液荧光强度随诱导剂浓度和培养时间的变化；B为脂肪烃含量与荧光强度的关系。图5本专利技术提供的高产脂肪烃基因的高通量筛选方法原理示意图。图6本专利技术实施例所提供的流式分选结果示意图；(图中，a为未诱导的细胞流式分析结果；b为0.05mMIPTG诱导的细胞流式分选结果)。图7通过定向进化筛选得到的ADO优势突变体的脂肪烃合成量和相对于野生型的提高水平；(其中，wt:作为突变模板的野生型脂肪醛脱甲酰加氧酶；3-3:ADO突变体I(E194K)；5-3:ADO突变体II(E9G&I27N)；5-7：ADO突变体III(I204F)；3-3/5-3:ADO突变体IV(E194K&E9G&I27N)。具体实施方式下面将结合附图和实施例对本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产脂肪烃基因的高通量筛选方法，其特征在于，将携带潜在产脂肪烃基因的载体导入到携带有检测元件的宿主细胞中，培养宿主细胞，通过对检测元件信号响应鉴别筛选目的基因的表达情况，并分离高产脂肪烃的突变体。

【技术特征摘要】
1.一种产脂肪烃基因的高通量筛选方法，其特征在于，将携带潜在产脂肪烃基因的载体导入
到携带有检测元件的宿主细胞中，培养宿主细胞，通过对检测元件信号响应鉴别筛选目的
基因的表达情况，并分离高产脂肪烃的突变体。
2.权利要求1所述筛选方法，其特征在于，步骤如下：
1)扩增产脂肪烃基因，并通过易错PCR反应引入随机突变，获得扩增产物；
2)将步骤1)获得的扩增产物经酶切后连接到含有抗性基因的质粒载体中，获得重组质
粒；
3)构建携带检测元件的宿主细胞，并将步骤2)所得的重组质粒转化至宿主细胞，获得
转化子；
4)培养步骤3)所得转化子，检测并根据对检测元件的信号响应进行目的基因表达的鉴
定并分离高产脂肪烃的突变体。
3.权利要求2所述筛选方法，其特征在于，步骤1)所述产脂肪烃基因，包括但不限于下列基
因中的一种或几种：脂肪醛脱甲酰加氧酶基因ADO、脂肪酸脱羧酶OleT、末端烯烃合成
酶Ols。
4.权利要求2所述筛选方法，其特征在于，步骤3)所述检测元件，包括脂肪烃检测元件和报
告元件。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，吴伟，梁雅静，张磊，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，波音中国投资有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37