构建生菜突变体库的EMS诱变浓度筛选制造技术

生菜具有杂交困难的问题，通过传统育种手段获得生菜杂交品种有很大的局限性，也使得生菜的种质资源开发受到限制。因此，为获得性状优良的生菜品种，可以从基因水平对其进行改造。通过获得大量的生菜突变体，从中筛选有义性状，结合分子生物学手段，获得与目标性状连锁的基因，为后期在基因水平上改造生菜的性状奠定基础。EMS是目前最常用的构建植物突变体库的化学试剂。本研究以生菜为材料，筛选最佳的EMS诱变浓度和诱变时间，达到生菜出芽率50%的目标，构建生菜突变体库，为后期进行生菜目标性状的筛选奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】一、
:本专利技术阐明采用EMS诱变构建生菜突变体库的方法，具体是通过设计不同浓度梯度的EMS溶液和不同时间梯度来鉴定最佳的EMS浓度和处理时间，达到生菜种子存活率50%的目标。二、
技术介绍
:生菜是一种重要的世界性蔬菜，种植面积广，食用人群大，但由于生菜自身的特点，人工杂交授粉具有一定的困难，在很大程度上限制了高品质、高抗逆性、高抗病性等的生菜品种的获得，也使得生菜的种质资源受到限制。因此寻找一种可以改良生菜品质、抗逆性、抗病性等的方法势在必行。通过EMS诱变，能够构建大容量的生菜突变体库，人们可以根据自己所需的目标性状，从突变体库中进行筛选，结合Tilling技术来进行突变基因的筛选及鉴定，从而获得目标基因，再通过转基因等技术，便可以对生菜目标性状进行改良。EMS是一种很好的化学诱变剂，属于烷化剂的一种，通常带有I个或多个活性烷基，该集团能够转移到电子密度高的分子上，使得碱基上不同位置增加烷基，从而改变氢键。EMS目前是作物诱变育种中应用最为广泛、效果最好的一种化学诱变剂，效率高、频率高、范围广。EMS的烷化作用主要是以烷基取代DNA鸟嘌呤N-7位置的H离子，使之成为一个带正电荷的季铵集团，从而产生两种遗传效应:一种为转换型突变，烷化的鸟嘌呤(G)代替胞嘧啶(C)，与胸腺嘧啶(T)配对；另一种是置换现象，鸟嘌呤的N-7烷基化，糖苷键断裂造成脱嘌呤，在复制过程中，脱嘌呤的DNA分子在原鸟嘌呤位置会出现空位，使之不受互补配对原则限制，A、T、G、C四种碱基都可与之配对，从而发生颠换或转换。三、
技术实现思路
:本专利技术以生菜种子为材料，设定不同的EMS浓度梯度及时间梯度，组成24个组合，分别进行发芽率的鉴定，由于生菜基因组未知，无法通过基因组大小来确定诱变群体大小，因此为了达到较好的实验数据，我们进行多次重复试验。浓度梯度和时间梯度包括:浓度(v/V)0.3%,0.5%,0.6%,0.7%,0.8%及 1.0%，分别处理 6h、8h、10h、12h。分别在不同时段计算不同浓度梯度的发芽率，最终确定EMS浓度为0.5% (v/V)，处理6h为最佳，出芽率为 52%。本专利技术的有益效果是:通过确定最佳EMS诱变的浓度梯度和时间梯度组合，来构建生菜突变体库，为后期筛选目标性状奠定基础。同时，为进一步结合Tilling技术筛选目标性转突变体和转基因技术获得高品质生菜品种提供数据参考依据。四、【附图说明】:图1是生菜EMS诱变浓度梯度及时间梯度图。图2是EMS诱变生菜种子发芽率图。五、【具体实施方式】:本研究主要目的为确定构建生菜突变体库所需EMS溶液的最适宜浓度和时间。根据已建立的不同蔬菜品种的EMS诱变浓度和实践，确定EMS浓度和时间的最大值和最小值，并设计梯度。每个处理用100粒种子，重复三次，最终确定最佳浓度和时间梯度。1、种子进行预处理；2、配制EMS溶液所需的磷酸缓冲液；3、根据设定的浓度梯度小心加入EMS溶液；4、将种子浸泡于EMS溶液中，放在摇床上，室温，不断震荡；5、配制IM的NaOH溶液，将接触过EMS溶液的全部容器浸泡于NaOH溶液中；处理过种子的EMS溶液同样倒入NaOH溶液中，进行去毒性处理，倒掉处理液；6、在不同的时间梯度，计算各浓度的种子出芽率，确定最佳EMS浓度和时间。实施例:构建生菜突变体库的EMS诱变浓度筛选I材料与方法1.1 材料由上海市农科院设施园艺所提供优质生菜种子。1.2研究方法1.2.1生菜种子预处理将生菜种子放入水中浸泡3_5h，使种皮软化，便于后期处理。1.2.2 配制 10mM 磷酸缓冲液，pH7.5a.配制 10mL IM 的 K2HPO4溶液和 10mL IM 的 KH 孑04溶液；b.分别取70mL IM的K2HPO4溶液和20mL IM的KH孑04溶液；c.用 IM 的 KH2PO4S液调整 pH 至 7.5 ;d.加水将IM的磷酸缓冲液稀释为10mM浓度。1.2.3 配制 EMS 溶液分别取5mL磷酸缓冲液，根据不同的EMS浓度，向缓冲液中缓慢滴加EMS溶液，终浓度(v/V)为0.3%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%及1.0%，注意不要接触皮肤，带好口罩。滴加EMS溶液需在通风橱内进行，以免挥发气体对人体造成伤害。EMS滴入后呈油滴状，需振汤混勾。1.2.4向各个EMS浓度梯度溶液中加入浸泡好的生菜种子，进行诱变处理每一个浓度和时间梯度，分别重复三次，每个重复处理100粒生菜种子。分别在不同的时间梯度计算不同EMS浓度下种子的发芽率，确定最佳处理浓度和时间。1.2.5 配制 IM 的 NaOH 溶液将接触过EMS溶液的全部实验用品浸泡于NaOH溶液中，将处理过种子的EMS溶液同样倒入NaOH溶液，进行去毒性处理，处理过的溶液可作为正常废液倒掉。EMS为据毒性化学试剂，必须进行去毒性处理方可倒掉，以免污染环境，对他人造成伤害。2实验结果在不同的时间梯度，分别计算生菜种子的出芽率。以水处理为对照，出芽率为95%，说明种子出芽良好。EMS诱变的不同浓度不同时间处理结果显示(如图)，3% (v/V)处理1h及0.5% (v/V)处理6h效果最佳，但由于浓度0.3% (v/V)处理1h时间过长，不利于种子发育，因此最终选择0.5% (v/V)处理6h为最佳。【主权项】1.构建生菜突变体库的EMS诱变浓度筛选，其特征在于:分别设定不同的EMS浓度梯度和处理的时间梯度，进行生菜种子的诱变；筛选最佳处理浓度和时间，种子出芽率达到50%，同时要保证筛选到的浓度不宜过高、处理时间不宜过长，尽量减少EMS的用量，缩短处理时间。2.根据权利要求1所述的构建生菜突变体库的EMS诱变浓度筛选，其特征在于:通过筛选最佳EMS诱变浓度和时间，能够在最大容量上构建生菜突变体库，为后期筛选目标性状突变体、结合Tilling等分子生物学技术筛选突变基因奠定基础。3.根据权利要求1或2所述的构建生菜突变体库的EMS诱变浓度筛选，其特征在于:筛选最佳EMS诱变浓度和时间，构建生菜突变体库，为筛选目标性状，结合分子生物学手段改造生菜性状提供依据。【专利摘要】生菜具有杂交困难的问题，通过传统育种手段获得生菜杂交品种有很大的局限性，也使得生菜的种质资源开发受到限制。因此，为获得性状优良的生菜品种，可以从基因水平对其进行改造。通过获得大量的生菜突变体，从中筛选有义性状，结合分子生物学手段，获得与目标性状连锁的基因，为后期在基因水平上改造生菜的性状奠定基础。EMS是目前最常用的构建植物突变体库的化学试剂。本研究以生菜为材料，筛选最佳的EMS诱变浓度和诱变时间，达到生菜出芽率50%的目标，构建生菜突变体库，为后期进行生菜目标性状的筛选奠定基础。【IPC分类】A01C1/00, A01H1/06【公开号】CN105580523【申请号】CN201510117357【专利技术人】张丽丽, 龚繁荣, 宋云鹏 【申请人】上海市农业科学院, 上海市科园种子有限公司【公开日】2016年5月18日【申请日】2015年3月18日本文档来自技高网...

【技术保护点】
构建生菜突变体库的EMS诱变浓度筛选，其特征在于：分别设定不同的EMS浓度梯度和处理的时间梯度，进行生菜种子的诱变；筛选最佳处理浓度和时间，种子出芽率达到50%，同时要保证筛选到的浓度不宜过高、处理时间不宜过长，尽量减少EMS的用量，缩短处理时间。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽丽，龚繁荣，宋云鹏，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，上海市科园种子有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31