本发明专利技术涉及高通量检测花生AhFAD2B基因SNP基因分型的引物及方法。引物包括：特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明专利技术可以高通量检测鉴别AhFAD2B基因等位基因变异情况，一次检测样本量最高可达1536个，检测成本低，快速、准确，大大提高了花生育种选择的效率和准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高通量检测花生AhFAD2B基因 SNP基因分型的引物及方法，属于分子 生物学
技术介绍
花生是世界四大油料作物之一，其籽粒脂肪酸的含量和组成是衡量花生品质的重 要指标。从油脂稳定性角度出发，高油酸/亚油酸比值（0/L比）的花生及其制品不易氧化 酸败，货架期较长。研究表明，烘焙后的高油酸花生比普通油酸含量花生贮存期延长8倍 (Mozingo et al.，2004)。油酸有益于维持有益胆固醇高密度脂蛋白（HDL)水平，可增强胰 岛素敏感性，并改善一些炎症（Mesa Garcia et al.，2006 ;Vassiliou et al.，2009)。工 业上常通过加氢提高油脂的饱和度，以提高油脂的稳定性，这往往在碳链中引入反式双键 生成反式脂肪酸，长期食用会大大增加罹患心脑血管病的几率。因此，花生籽粒的高油酸含 量和高0/L比值就成为了花生油脂遗传改良的主要目标。 FAD2是控制植物籽粒油酸、亚油酸含量的关键酶，它催化油酸在碳12位去饱和产 生亚油酸。花生是异源四倍体（2n = 4X = 40,基因组AABB)，AhFAD2A和AhFAD2B是位于 不同基因组上的非等位基因，这两个基因对油酸、亚油酸含量均有贡献，这两个基因转录受 到抑制或酶活降低，籽粒会表现出高油酸性状。美国上世纪80年代通过化学诱变和自然 突变筛选获得的一些高油酸突变体（如F435,8-2122, M2-225, MF) (Norden et al.，1987 ; Ashri, 1988)，一直作为亲本沿用至今。这些品种或品系籽粒油酸含量都在80%左右。分 析F435及其衍生系高油酸性状的遗传基础发现，AhFAD2B基因编码区442nt处1个A碱 基插入，导致编码蛋白提前终止。针对上述突变体及衍生系AhFAD2B基因的SNP差异，近 年来开发了多种用于检测的标记和检测方法，如酶切扩增多态性序列法（CAPS，cleaved amplified polymorphic sequence)、等位基因特异 PCR (AS-PCR, Allele-Specific PCR)、 测序法、实时荧光定量PCR法等，从而实现对高油酸花生育种进行辅助选择（Jung et al·，2000a ;Chu et al·，2007 ;Chu et al·，2009 ;Chen et al·，2010)。目前我国也培育出 了几个高油酸花生品种，如山东花生研究所培育的花育32 (2009年山东省审定）、花育51和 花育52,河南省开封市农林科学研究院开农H03-3、开农61、开农176、开17-15,河北省冀花 11号、13号等。这些品种与突变体F435 AhFAD2B基因在442nt处的突变位点相同。可以 使用相同的标记和检测方法。 以上检测方法仅荧光定量PCR方法可以实现高通量检测，TaqMan探针法针对 AhFAD2B基因442位InDel差异的检测十分有效，但由于该方法荧光标记的探针为基因特异 性探针，检测成本相对较高。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种高通量检测花生FAD2B基因 SNP基因分型 的引物及方法。本专利技术设计了 AhFAD2B基因的特异性扩增引物及通用引物，结合应用条件 严格的Touchdown PCR方法，建立了应用LGC高通量标记检测平台检测花生AhFAD2B基因 等位变异的方法。 本专利技术是通过如下技术方案实现的： -种高通量检测花生AhFAD2B基因 SNP基因分型的引物，包括： 特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示； 通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。 序列表中SEQ ID No. 1由21个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因 ORF区自Y端 441-461位碱基的反向互补序列；SEQ ID No. 2由22个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因 ORF区自Y端442-463位碱基的反向互补序列；序列表中SEQ ID No. 3由22个碱基组成， 该序列为AhFAD2B基因 ORF区自Y端415-436位碱基序列。在SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的Y端分别连接了 Allele-I tail和Allele-2 tail，这两条加尾序列分别与LGC公 司Master Mix检测试剂盒中的通用荧光探针的序列相同，探针的5'端分别标记了 FAM和 HEX荧光基团，该探针由LGC公司研发产售。 -种高通量筛选AhFAD2B基因等位变异的方法，包括如下步骤： ⑴提样品的DNA，经12000g离心后，65°C烘干20~35min，制得基因组DNA ; (ii)以步骤⑴制得的基因组DNA为模板，配制含有FAM淬灭基团和HEX淬灭基 团的PCR反应体系，进行PCR扩增，检测荧光强度，读取数据；引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3 所示； (iii)对步骤（ii)的数据进行分析，当检测到仅有FAM探针的荧光时，则第442位 为A碱基缺失纯合，即野生基因型，记为BB ;当检测到仅有HEX探针的荧光时，则第442位A 碱基插入纯合，即突变基因型，记为bb ;当检测到有FAM探针和HEX探针的荧光时，则第442 位为杂合子，记为Bb。 根据本专利技术优选的，所述步骤（ii)中，含有FAM淬灭基团和HEX淬灭基团的PCR 反应体系由LGC公司销售的含有FAM淬灭基团和HEX淬灭基团的Master Mix、基因组DNA 和引物组成； 进一步优选的，所述步骤（ii)中的PCR反应体系为1 μ L，组分如下： 引物 0.013pL Masi-Cr Mix 0.5 μL 基因组DNA 10-50ng CidH7O 余 A 根据本专利技术优选的，所述步骤（ii)中，PCR扩增反应条件如下： 94°C 预变性 15min ; 第一步扩增反应，94°C变性 20s，61°C -55°C退火，61°C -55°C延伸 60s，10 个 Touch Down循环，每个循环降低0· 6°C ; 第二步扩增反应，94°(：变性2〇8,55°(：退火，55°(：延伸6〇8,26个循环。 根据本专利技术优选的，所述步骤（ii)中，检测荧光强度的温度为40°C以下。 根据本专利技术优选的，所述步骤（ii)中，数据读取使用LGC公司SNPviewer软件进 行。 根据本专利技术优选的，所述步骤（iii)中，结果分析使用LGC公司SNPviewer软件进 行。该软件可高通量检测AhFAD2B基因442nt A碱基的缺失或插入。 有益效果 1、本专利技术针对与花生油酸亚油酸含量密切相关的AhFAD2B ORF区442位A碱基的 缺失与插入，选择GC含量较高的区段，分别设计了特异性引物，以确保基因分型的准确性； 2、本专利技术在设计引物时，考虑到等位变异位点序列的差异，将分型鉴定的1个碱 基差异设计在两个特异性引物的3'端，通过Touch Down PCR确保扩增的特异性； 3、本专利技术可以高通量检测鉴别AhFAD2B基因等位基因变异情况，一次检测样本量 最高可达1536个，检测成本低，快速、准确，大大提高了花生育种选择的效率本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高通量检测花生AhFAD2B基因SNP基因分型的引物，其特征在于，包括：特异引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；通用引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：单雷，徐平丽，唐桂英，刘玮，谷朝阳，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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