可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对ESRRG基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对喉癌的检测，检测效率高，针对性强，同时，以ESRRG基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为喉癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种辅助诊断喉癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
技术介绍
喉癌(Laryngealcarcinoma，LC)是头颈部常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国北方地区位于头颈部恶性肿瘤的第一位，在我国南方地区，仅次于鼻咽癌居于第二位：在世界范围内，居于全身恶性肿瘤的第十一位，约占全球每年新发恶性肿瘤的1-2.5%，其中喉鳞状细胞癌约占90％。目前研究表明喉癌的发生发展与生活习惯、环境因素、遗传和表观遗传学等多种复杂的因素相关。近年来，随着人们生活水平的提高，环境因素恶化等影响，我国喉癌的发病率和死亡率增长迅速，而且发病年龄明显提前。由于喉癌的早期症状不明显，病理学活检是其诊断的金标准，确诊时患者多数已进入中、晚期，许多患者在疾病发生的早期没有得到及时的诊断和治疗，对喉癌的治疗和预后带来了极差的影响。尽管近几十年来外科技术和辅助治疗得到不同程度的提高，但是目前喉癌的五年生存率仍未明显增长，原因之一就是目前喉癌发病的分子学机制仍不清楚，早期诊断及治疗不理想。因此，有必要探索具有高敏感性和特异性的分子检测指标，对喉癌患者做到早发现，早诊断，早治疗，提高喉癌患者总体生存率。雌激素相关受体伽马（estrogen-relatedreceptorgamma，ESRRG)是雌激素相关受体(Estrogen-relatedreceptors，ERRs)家族中的一员，定位于染色体1q41（chr1:216676588-217311097），cDNA全长3.0kb，编码一条长458氨基酸多肽链。因其尚未发现天然配体，故也称为孤核受体。雌激素相关受体可通过两个锌指结构组成的DNA结合域，和其它转录因子之间相互作用或结合DNA序列上的反应元件，调控多种基因的转录，参与细胞增殖、分化、凋亡、胞内信号传导、核内信号信息的交流等过程。最近国内外的一些研究表明，通过上调雌激素相关受体伽马的表达可增加E-钙黏蛋白表达，继而促进间质向上皮转化，并在体内抑制乳腺癌的生长。同样，将雌激素相关受体伽马基因前体进转染入前列腺癌细胞系LnCaP和DU145，可在体外显著抑制肿瘤增殖和在体内抑制肿瘤形成，表明雌激素相关受体伽马（estrogen-relatedreceptorgamma，ESRRG)在多种肿瘤中起到抑癌基因的作用。但是目前，国内外还没有公开任何关于在喉癌中用于检测雌激素相关受体伽马基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因ESRRG甲基化水平与喉癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断喉癌。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括ESRRG基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：5’-TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3’；所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5’-Biotin-TCTTTTCAAATCCATCACTAA-3’；所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：5’-GGGAGATGAATTGGG-3’。上述可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于喉癌辅助检测、诊断或药物治疗中。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含雌激素相关受体伽马基因启动子区的甲基化特异性上游引物、甲基化特异性下游引物及其甲基化特异性测序引物。雌激素相关受体伽马基因启动子区域的高甲基化，影响转录因子与DNA间的相互作用，或改变染色质结构从而导致雌激素相关受体伽马基因的低表达，从而影响喉癌的发生和发展。因此，雌激素相关受体伽马基因启动子区甲基化水平与喉癌的患病率呈正相关，通过检测雌激素相关受体伽马基因启动子区甲基化程度辅助诊断喉癌，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于喉癌的早期发现和及时治疗。综上所述，以基因ESRRG启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对喉癌的检测，同时，以ESRRG基因启动子区域DNA甲基化为靶点的药物有望成为喉癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。附图说明图1为被检测序列所在区域（具体位置为chr1:217311596-217311629），以及所检测的6个CpG点之间的关联性分析结果（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.891，CpG2与CpG3的相关系数为0.942）；图2为DNA甲基化水平检测结果示意图（如图示CpG1到CpG6的甲基化程度分别为66%，64%，61%，61%，65%，66%）；图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平（即阴影框对应的上方数字）。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。具体实施例1、研究对象的收集本研究选取宁波市某三甲医院手术切除的喉癌患者93例手术标本作为研究对象。所有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和纤维喉镜镜检查等，并得到术后病理诊断确认。手术切除喉癌组织和癌旁组织（距离癌组织至少5cm以上的正常组织）立即保存于-80度液氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。2、基因组DNA的提取采用QIAampDNAMiniKit(Qiagen,Hilden,德国)DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，ThermoFisherScientific)检测所得DNA的浓度，以供ESRRG基因启动子区DNA甲基化水平的检测。3、DNA甲基化水平测定本实验采用焦磷酸测序技术对ESRRG基因启动子区的6个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMarkAssayDesign软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如下：5’-TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3’；甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如下：5’-Biotin-TCTTTTCAAATCCATCACTAA-3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于包括ESRRG基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’‑TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG‑3’；所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’‑Biotin ‑TCTTTTCAAATCCATCACTAA ‑3’；所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’‑GGGAGATGAATTGGG ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种可用于检测与喉癌相关的ESRRG基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于包括ESRRG基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：
5’-TAGAGTTAGAGGGAGATGAATTG-3’；
所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈志森，周重昌，
申请(专利权)人：宁波市医疗中心李惠利医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33