检测CDA基因第79、208和435位点的引物和方法技术

本发明专利技术公开了检测编码胞苷脱氨酶的基因CDA第79、208和435位点的引物和方法，所述引物包括扩增CDA基因第79，208和435位点正、反向引物和测序引物。基于采用Sanger测序法，利用所述引物和方法可用于快速检测CDA基因第79，208和435位点的突变情况，并为患者使用二氟核普类抗代谢抗肿瘤药吉西他滨的用药情况提供参考。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测CDA基因第79、208和435位点 的引物和方法。
技术介绍
吉西他滨是一种破坏细胞复制的二氟核普类抗代谢抗肿瘤药，在临床上广泛用 于非小细胞肺癌的一线治疗，同时对于包括胰腺癌、胆囊癌、乳腺癌和平滑肌肉瘤等在内 的其他许多实体瘤具有活性。但是，该药的治疗窗小，易引发以骨髓抑制为主的不良反应。 有研宄表明，编码胞苷脱氨酶CDA的基因序列中的单核昔酸多态性可能会影响吉西他滨的 血药浓度，进而影响其用药后的不良反应乃至疗效。有研宄表明CAD基因多态性位点包括 第79位点的突变A79C (即Lys27Gln)，第208位点的突变G208A (即Ala70Thr)和第435位 点的突变 C435T (即 Thr 145Thr)。
技术实现思路
本专利技术提供检测CDA基因第79、208和435位点的引物，采用Sanger测序法，可用 于快速检测CDA基因第79、208和435位点突变的情况。 本专利技术的目的之一在于提供检测CDA基因 A79C(Lys27Gln)，G208A(Ala70Thr) 和C435T(Thrl45Thr)位点的引物，包括：扩增覆盖检测CDA基因第A79C(Lys27Gln)， G208A(Ala70Thr)和C435T(Thrl45Thr)位点的正、反向引物和测序引物；其碱基序列为： CDA79-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ； CDA79-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ； CDA208-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ； CDA208-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ； CDA435-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ； CDA435-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ； 测序-F : TGTAAAACGACGGCCAGT ; 测序-R :AACAGCTATGACCATG。 进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：CDA79-F:CDA79-R = 1:1,CDA7208-F:CDA208-R = I:I, CDA435-F:CDA435-R = 1:1〇 进一步地，所述测序引物的使用浓度比为：测序-F:测序-R = 1:1。 本专利技术的目的之二是提供一种检测检测CDA基因第A79C (Lys27Gln)， G208A(Ala70Thr)和C435T(Thrl45Thr)位点的方法，其包括如下步骤： (1)提取样品 DNA ; (2)利用扩增引物 CDA79-F/CDA79-R，CDA208-F/CDA208-R，CDA435-F/CDA435-R 对 (1)中的DNA分别进行扩增，获得检测CDA基因第A79C(Lys27Gln)，G208A(Ala70Thr)和 C435T(Thrl45Thr)位点的扩增产物； (3)利用测序引物测序-F与测序-R对⑵中的扩增产物分别进行正向和反向测 序，获得所述扩增产物的基因序列； (4)将（3)中的基因序列与野生型CDA基因序列进行比较，确定突变位点是否存 在； 其中所述引物序列为： CDA79-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ； CDA79-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ； CDA208-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ； CDA208-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ； CDA435-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ； CDA435-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ； 测序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT ; 测序-R :AACAGCTATGACCATG。 本专利技术的目的还在于提供一种检测CDA基因第79、208和435位点的试剂盒，所 述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性 对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括3对扩增引物CDA79-F/ CDA79-R，CDA208-F/CDA208-R，CDA435-F/CDA435-R，测序体系包括测序引物测序-F 与测 序-R，包括： CDA79-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG ； CDA79-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC ； CDA208-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT ； CDA208-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG ； CDA435-F ：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC ； CDA435-R ：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG ； 测序-F :TGTAAAACGACGGCCAGT ; 测序-R :AACAGCTATGACCATG。 进一步地，所述检测体系PCR反应液还包括2 X PCR Buffer ;dNTPs ;K0D FX DNA Polymerase。 进一步地，所述测序体系还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75%乙醇、HIDI和 Bigdye Terminator V3.1〇 进一步地，所述测序纯化液包括虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I。 本专利技术的有益效果是：本专利技术设计了扩增覆盖检测CDA基因第79、208和435位 点的正、反向引物，并创新性的在PCR扩增上游引物前端和下游引物前端分别加了一段长 18bp的测序引物的正向引物序列和长16bp的测序引物的反向引物序列。这样扩增以后的 产物两端都会带上所引入的所述的测序引物序列，随后进行测序反应的时候，所有的扩增 产物可以使用相同的测序引物就可以完成不同基因的正反向测序，很大程度的节省了检测 成本。对送检样本进行PCR扩增，采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩 增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测CDA基因第79、208和435位点的突变情况。通 过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。 另一方面利用本专利技术所述扩展引物和测序引物，可以扩增包含第79、208和435位 点，通过测序结果的分析，可以很直观的了解CDA基因第79、208和435位点基因突变情况， 并不受CDA基因突变多样化以及没有突变热点的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；具 有很高的特异性及准确性；采用PCR方法扩增目的基因并测序检测其基因多态性，具有灵 本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测CDA基因第79位点、第208位点和第435位点的引物，其特征在于，包括：扩增覆盖CDA基因第79、208和435位点的正、反向引物和测序引物；其碱基序列为：CDA79‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGTGTGAAGCACACGTAGG；CDA79‑R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCGCCTCTTCCTGTACATC；CDA208‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCTGCTCTCTTCTCAGGGT；CDA208‑R：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTGGCTAAAGAGATGAATG；CDA435‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTCACGCCAGCTTTGCC；CDA435‑R：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGGCTGGAGTGTAATCTG；测序‑F：TGTAAAACGACGGCCAGT；测序‑R：AACAGCTATGACCATG。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙翠莲，黎洪奋，王淑一，
申请(专利权)人：南昌艾迪康临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36