本发明专利技术公开了可用于检测与大肠癌相关的MDFI基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对MDFI基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，检测效率高，针对性强，同时，以MDFI基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】可用于检测与大肠癌相关的MDFI基因启动子区甲基化程 度的试剂盒及其应用 本专利技术涉及一种辅助诊断大肠癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与大 肠癌相关的/基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
技术介绍
大肠癌（Colorectal Cancer，CRC)又称结直肠癌，是消化系统中常见的恶性肿瘤。 目前研宄表明大肠癌是大肠黏膜上皮细胞在遗传和环境等多种复杂的因素共同作用下，发 生遗传和表观遗传的改变而获得无限增殖，躲避凋亡程序等能力，从而在局部形成肿块。近 年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯与结构的改变，加之人口老龄化趋势的影响，我 国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速，而且发病年龄明显提前。尽管目前手术方式和辅助 治疗手段不断改进，大肠癌的患者的术后生存情况有了较大的改善，但是CRC患者的五年 总体生存率仍旧不高，其中最重要的一个因素就是，许多患者在疾病发生的早期没有得到 及时的诊断和治疗。因此，有必要探索其他分子指标独立或者联合CEA等检测，对大肠癌患 者做到早发现，早诊断，早治疗，提高大肠癌患者总体生存率。 信号转导就是各类信号包括分子信号或外源刺激信号等通过细胞膜或细胞内信 使分子介导，最终引起核内靶基因表达改变的过程。细胞信号转导过程发生障碍或异常， 必然会导致细胞生长、增殖、分化和代谢等一系列生物学异常，从而引起各种疾病甚至肿瘤 的发生。Wnt信号转导通路在生物发育、细胞转运以及细胞凋亡等生命过程中发挥重要作 用，其异常活化与消化道肿瘤的发生、发展有关。Wnt信号转导通路主要有两种作用机制： 经典途径和非经典途径。经典Wnt信号转导通路：当细胞分泌的Wnt家族分泌蛋白（Wnt) 同时与细胞跨膜特异受体卷曲蛋白（Frizzled，Frz)和辅助受体低密度脂蛋白受体相关 蛋白 5/6(low density lipoprotein receptor related protein5/6)结合后，角虫发细胞 内信号转导，活化的细胞内散乱蛋白（Dishevelled，Dsh)，活化的Dsh能抑制细胞质内 0-连环蛋白（0-catenin)、轴蛋白或转导蛋白（Axin or Conductin)、结直肠腺瘤性息肉 (adenomatouspolyposis coli, APC)基因产物、糖原合成酶激酶 3 0 (glycogen synthase kinase-3 |3，GSK-3 |3 )复合物的形成（该复合物能够降解细胞内|3 -catenin)，导致细胞内 0-catenin的积累并转移至细胞核内，与核内转录因子（T cell factor，TCF)/淋巴样增 强因子（lymphoid enchancing factor，LEF)结合，刺激 Wnt 信号革巴基因 遞P-蹲的转录。 生肌决定因子基因家族抑制基因（MyoD family inhibitor,層/7/ or the inhibitor of the myogenic family,I~mfa)位于 6 号 染色体 (hr6:41，606, 198-61，621，982)，其编码产物生肌决定因子基因家族抑制蛋白（MyoD family inhibitor,MDFIorthe inhibitor of the myogenic family,I-tufa),^一种 转录调节因子，能通过与肌源蛋白家族其他成员结合并且掩盖生肌决定因子转入细胞核内 的信号，从而抑制肌细胞形成过程。除此之外，有研宄表明，生肌决定因子基因家族抑制蛋 白（MyoD family inhibitor,MDFIorthe inhibitor of the myogenic family,I~mfa) 能够通过与核内转录因子（T cell factor, TCF)/淋巴样增强因子（lymphoid enchancing factor，LEF)结合而抑制Wnt信号转导通路。有研宄发现，在胰腺癌的发生发展过程中，生 肌决定因子基因家族抑制基因（MyoD family inhibitor,層Z7/ or the inhibitor of the myogenic family, 因启动子区高甲基化而失活。目前，国内外还没有公开任何关 于用于检测大肠癌中生肌决定因子基因家族抑制基因（MyoD family inhibitor，MFJ or the inhibitor of the myogenic family，启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关 研宄报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可 用于检测与大肠癌相关的/基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因 甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断 大肠癌。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与大肠癌相关的 基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括/基因启动子区的甲基化特异性扩增上 游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' -Biotin -GTGTTAGGTTTTTGGTTGGGTTAAG-3' ； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' -CCCCTTCCTTCTTCCTTCTCT-3' ； 所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' -CTTCCCTAACCCACC-3'。 -种可用于检测与大肠癌相关的/基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应 用，该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了可用于检测与大肠癌 相关的/基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含生肌 决定因子基因家族抑制基因（MyoD family inhibitor，層/Y or the inhibitor of the myogenic family, 启动子区的甲基化特异性上游引物、甲基化特异性下游引物及 其甲基化特异性测序引物。生肌决定因子基因家族抑制基因启动子区域的高甲基化，影响 转录因子与DNA间的相互作用，或改变染色质结构从而导致生肌决定因子基因家族抑制基 因的低表达，从而影响大肠癌的发生和发展。因此，生肌决定因子基因家族抑制基因启动子 区甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，通过检测生肌决定因子基因家族抑制基因启动 子区甲基化程度辅助诊断大肠癌，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活 快速和经济节约的优点，有利于大肠癌的早期发现和及时治疗。 综上所述，以基因启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快 捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，同时，以/基因启动子区域DNA甲基化为靶点 的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。【附图说明】 图1为被检测序列所在区域(具体位置为chr6:41，606, 076-41，606, 130)，以及所 检测的7个CpG点之间的关联性分析结果(例如CpGl与CpG2的相关系数为0. 943, CpG2与 C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可用于检测与大肠癌相关的MDFI基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于包括MDFI基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’‑Biotin ‑GTGTTAGGTTTTTGGTTGGGTTAAG‑3’；所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’‑CCCCTTCCTTCTTCCTTCTCT‑3’；所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’‑CTTCCCTAACCCACC‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段世伟，叶孟，李锦芸，陈成，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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