本发明专利技术提供一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法，步骤如下：（1）构建重组阴性质粒和重组阳性质粒；（2）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；（3）根据收集数据绘制高分辨率溶解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的溶解曲线判断待测样本FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型。本发明专利技术的方法能够有效检测FoxH1基因SNP位点rs750472的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明专利技术的方法分析结果与测序结果完全一致，能够可用于室间隔缺损型心脏病的辅助判断。
【技术实现步骤摘要】
[00011 本专利技术涉及一种检测F0XH1基因 SNP位点rs750472基因型的方法。
技术介绍
叉头框(F0X)基因家族作为一种转录因子，广泛存在于生物体中。该基因家族成员 功能各异，但它们都具有一个高度保守的叉头DNA结构域，该结构域包括由100多个氨基酸 组成的螺旋-转角-螺旋基序，3个α螺旋组成的核心区域和2个可与靶DNA分子相互作用的环 组成的翼状结构。该家族基因通过激活或抑制靶基因的转录和表达，对机体的发育、分化、 代谢等起关键的调节作用。所有的F0X基因的家族成员都可以通过DNA结构域结合DNA，其功 能涉及细胞分化状态的维持、组织特异性基因的表达、胚胎发育、细胞周期调控、糖类及脂 类代谢、细胞凋亡等多个生物学过程，并且其基因突变与发育畸形、肿瘤发生发展密切相 关。 先天性心脏病(congenital heart diseases，CHDs)有很多种类型，通常将其分为 简单和复杂的先天性心脏病。简单的先天性心脏病有以下三种:室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)、房间隔缺损（atrial septal defect,ASD)、动脉导管未闭（patent ductus arteriosus, PDA)。复杂的先天性心脏病主要包括以下几种：法洛四联症 (tetralogy of Fallot，T0F)、肺动脉瓣狭窄（pulmonary stenosis，PS)、大动脉异位 (transposition of the great arteries，TGA)、主动脉缩窄（aortic stenosis,AS)、右 室双出口（double-outlet right ventricle，D0RV)，房室传导阻滞（atrioventricular block，AVB)等。其中室间隔缺损（以下简称为VSD)在新生儿CHDs患者中的发病率约为20%， 在儿童中约为30%，是所有CHDs患者中发病率最高的一种。VSD是指胚胎发育时期室间隔发 育不全，左右心室之间存在一直接开口，产生左向右分流。VSD可单独发生，形成单纯性室间 隔缺损，也可能是某种复杂心脏畸形的组成部分之一，形成非单纯性室间隔缺损。这种心脏 缺损会导致左心室的富氧血液流入右心室而非正常流入主动脉。甘肃省六地市2-19岁人群 调查结果表明CHDs总患病率为0.571 %，其中VSD占52.72%。尽管大多数VSD可通过手术方 式来纠正，但手术治疗会给患儿家庭和社会带来沉重的经济负担，而且VSD患者术后发生 心脏功能异常的机率较正常人大大增加。因此，寻找和检测VSD相关基因，用于产前诊断和 基因治疗，以最大可能地避免VSD患儿出生及纠正遗传缺陷，是当前心血管领域研究重点内 容。 高分辨率溶解曲线(high resolution melting, HRM)分析技术是于2003年由美 国Utah大学Wittwer实验室提出的基于新型饱和突光染料LC Green专利技术而进行基因突变检 测的一项新技术。HRM分析原理是在常规聚合酶链式反应(PCR)后饱和荧光染枓与双链DNA 结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突 变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中 的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上就可以判断是否存在突变或SNP，而且不同位点、 杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形。因此，HRM分析能够有效区分 不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。
技术实现思路
本申请人经研究发现:核转录因子F0XH1基因是DNA结合蛋白winged helix转录因 子家族的新成员，在VSD信号通路中起到重要的转录调节的作用。在不区分性别的情况下， 当FoxHl基因 SNP位点rs750472的基因型为GG或TG时，先天性心脏病易感性(VSD)增加。具体 实验如下： 选取573名来医院就诊的患者，其中对照组276人，VSD患者组为297人。对照组rs750472 位点的TT，GT，GG基因型频率分别为57.6%，35.9%及6.5%; VSD患者中相应基因型频率分别为 39.4%，45.5%及15.2%。!1，G等位基因频率在VSD病患组中分别为61.6%和38.4%;对照组相对 应的等位基因频率分为75.5%和24.5%，详见表1。 表1对照组与VSD患者组的基因型频率及等位基因频率 由表1可知： 以野生等位基因 T做为参照，则G等位基因频率在病患组和对照组之间的差异性具有显 著的统计学意义，Ρ=〇· 005，0R=1.883( 1.210-2.931)。 以野生基因型TT做为参照，GT基因型频率在病患组和对照组之间有差异性，P= 0.047，0R=1.853(1.006-3.412) AG基因型频率在病患组和对照组之间的差异具有显著的 统计学意义，P=〇 · 016，0R=3 · 397(1 · 209-9 · 546)。 为此，本申请人设计了一种检测FoxHl基因 SNP位点rs750472基因型的方法，用来 检验FoxHl基因 SNP位点rs750472的基因型，该结果可用于室间隔缺损型心脏病的辅助判 断。 本专利技术的第一个目的是提供一种检测F0XH1基因 SNP位点rs750472基因型的方法， 步骤如下： (1) 构建重组阴性质粒和重组阳性质粒;所述重组阴性质粒的核苷酸序列参见序列表 中SEQ ID No. 1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2; (2) 提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的 外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据； 作为优选，所述HRM分析的条件为:94°C 90s;60°C 30s;83-94°C收集数据，温度上升速 率为 0.06°C/s; (3)根据收集数据绘制高分辨率溶解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的溶解曲 线判断待测样本F0XH1基因 SNP位点rs750472的基因型： 与重组阴性质粒的溶解曲线重合则F0XH1基因 SNP位点rs750472的基因型为TT; 与重组阳性质粒的溶解曲线重合则F0XH1基因 SNP位点rs750472的基因型为GG; 在重组阴性质粒和重组阳性质粒的溶解曲线之间的则F0XH1基因 SNP位点rs750472的 基因型为TG。作为优选，所述PCR扩增时所用引物为（1)或(2)中的一种： (1) 上游引物:F0XH1-F 5 '- ACCAGGGAAGACGGGATAAAGT-3 ' ； 下游引物:F0XH1-R 5'- TCTAGTGGGGGCTTCTCCTGA-3' ； (2) 与（1)中的互补序列。 上述引物的衍生序列也在本专利技术的保护范围内，所述衍生序列为向5'端和/或3' 端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。 作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为： Green-2-Go qPCR Mastermix(含EvaGreen) 5μ1 引物 F(10yM) Ο.?μL 引物 R(10yM) Ο.?μL 模板(50ng本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测FOXH1基因SNP位点rs750472基因型的方法，其特征在于：步骤如下：（1）构建重组阴性质粒和重组阳性质粒；所述重组阴性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.1，所述重组阳性质粒的核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；（2）提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃ 90s；60℃ 30s；83‑94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；（3）根据收集数据绘制高分辨率溶解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的溶解曲线判断待测样本FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型：与重组阴性质粒的溶解曲线重合则FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型为TT；与重组阳性质粒的溶解曲线重合则FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型为GG；在重组阴性质粒和重组阳性质粒的溶解曲线之间的则FOXH1基因SNP位点rs750472的基因型为TG。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢小冬，车团结，尤崇革，沈颂东，李琳，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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