可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对SSTR2基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，检测效率高，针对性强，同时，以SSTR2基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

【技术实现步骤摘要】
可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种辅助诊断大肠癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
技术介绍
大肠癌(ColorectalCancer，CRC)又称结直肠癌，是消化系统中常见的恶性肿瘤。目前研究表明大肠癌是大肠黏膜上皮细胞在遗传和环境等多种复杂的因素共同作用下，发生遗传和表观遗传的改变而获得无限增殖，躲避凋亡程序等能力，从而在局部形成肿块。近年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯与结构的改变，加之人口老龄化趋势的影响，我国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速，而且，发病年龄明显提前。世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告2014》显示中国癌症新增病例和死亡人数的绝对数值位居世界首位。其中以胃癌、食道癌、大肠癌为代表的消化道癌症威胁最为显著。尽管目前手术方式和辅助治疗手段不断改进，大肠癌的患者的术后生存情况有了较大的改善，但是CRC患者的五年总体生存率仍旧不高，其中最重要的一个因素就是，许多患者在疾病发生的早期没有得到及时的诊断和治疗。因此，有必要探索其他分子指标独立或者联合CEA等检测，对大肠癌患者做到早发现，早诊断，早治疗，提高大肠癌患者总体生存率。生长抑素受体2(somatostatinreceptor2,SSTR2)是生长抑素受体家族(somatostatinreceptors，SSTRs)中的一员。生长抑素受体家族(somatostatinreceptors,SSTRs)是一类介导生长抑素及其类似物，具有多种生物学效应的C蛋白偶联受体家族，包括SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4以及SSTR5，可以通过cAMP、PTP和MAPK信号通路，在调控GH分泌、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增生、抑制胰岛素作用和抑制细胞生长等生物学过程发挥重要作用。生长抑素受体2蛋白(somatostatinreceptor2,SSTR2)是位于17号染色体的生长抑素受体2基因(chr17:71，161，160-71，168，062)编码产物。生长抑素受体2蛋白在调控动物的生长过程中起主要作用，主要抑制GH、胰岛素释放，参与介导肿瘤的抗增殖作用以及诱导细胞凋亡，是介导抗肿瘤作用的主导亚型。国外有研究表明在多种人类细胞株中，生长抑素受体2(somatostatinreceptor2，SSTR2)基因的表达受启动子区DNA甲基化表观遗传调控。但是目前，国内外还没有公开任何关于在大肠癌中用于检测生长抑素受体2基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因SSTR2甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断大肠癌。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括SSTR2基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：5’-Biotin-AGGGTAGAGGAGTTAGGAATTT-3’；所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5’-ACCCCTCACCTTTACTTTTC-3’；所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示：5’-ACCCAACCACTATCCC-3’。一种可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应用，该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含生长抑素受体2基因(somatostatinreceptor2,SSTR2)启动子区的甲基化特异性上游引物、甲基化特异性下游引物及其甲基化特异性测序引物。生长抑素受体2基因启动子区域的高甲基化，影响转录因子与DNA间的相互作用，或改变染色质结构从而导致生长抑素受体2基因的低表达，从而影响大肠癌的发生和发展。因此，生长抑素受体2基因启动子区甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，通过检测生长抑素受体2基因启动子区甲基化程度辅助诊断大肠癌，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于大肠癌的早期发现和及时治疗。综上所述，以基因SSTR2启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，同时，以SSTR2基因启动子区域DNA甲基化为靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。附图说明图1为被检测序列所在区域（具体位置为chr17:71,161,315-71,161,371），以及所检测的9个CpG点之间的关联性分析结果（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.885，CpG2与CpG3的相关系数为0.894)）；图2为DNA甲基化水平检测结果示意图（如图示CpG1到CpG9的甲基化程度分别为35%，31%，33%，30%，21%，36%，28%，25%，11%）；图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基种类可分析得到其甲基化水平（即阴影框对应的上方数字）。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。具体实施例1、研究对象的收集本研究选取宁波市某三甲医院手术切除的大肠癌患者42例手术标本作为研究对象。所有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和结肠镜检查等，并得到术后病理诊断确认。手术切除大肠癌组织和癌旁组织(距离癌组织至少5cm以上的正常组织)立即保存于-80度液氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研究对象都签署知情同意书。2、基因组DNA的提取采用QIAampDNAMiniKit(Qiagen,Hilden,德国)DNA提取试剂盒提取组织全基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，ThermoFisherScientific)检测所得DNA的浓度，以供生长抑素受体2基因启动子区DNA甲基化水平的检测。3、DNA甲基化水平测定本实验采用焦磷酸测序技术对生长抑素受体2基因启动子区的9个CpG位点(如图1)进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应(PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶(C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶(U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMarkAssayDesign软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：5’-Biotin-AGGGTAGAGGAGTTAGGAATTT-3’；所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：5’-ACCCCTCACCTTTACTTTTC-3’；所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于包括SSTR2基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’‑Biotin ‑AGGGTAGAGGAGTTAGGAATTT‑3’；所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’‑ACCCCTCACCTTTACTTTTC‑3’；所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’‑ACCCAACCACTATCCC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种可用于检测与大肠癌相关的SSTR2基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于包括SSTR2基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：5’-Biotin-AGGGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：段世伟，叶孟，李锦芸，陈成，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33