多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒，其用于同时检测隐孢子虫、贾第虫，环孢子虫和微孢子虫，该试剂盒包括如下引物：隐孢子虫的特异性引物：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2；贾第虫的特异性引物：SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4；环孢子虫的特异性引物：SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6；微孢子虫的特异性引物：SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8。此外本发明专利技术还公开了一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的多重PCR检测方法。通过各种验证表明本发明专利技术具有快速、敏感、特异性强的特点，解决了进行多次PCR检测的繁琐步骤，一次反应可以达到同时检测多个基因，明确病原体的作用，大大减轻了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本，具备更大的发展趋势。

【技术实现步骤摘要】
多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒及检测方法
本专利技术涉及农业和动物检疫
，具体涉及一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的检测方法，尤其涉及一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的多重PCR检测方法及试剂盒。此外，本专利技术涉及用于同时检测隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的引物。
技术介绍
隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫(简称贾第虫)、环孢子虫和微孢子虫为人兽共患新发肠道原虫，主要介水传播，引起消耗性腹泻，是全球面临的重要公共卫生问题，也是人类迄今为止面临的最困难的问题之一；可暴发流行，造成严重的突发公共卫生事件。人的感染主要是摄入被卵囊/包囊等污染的饮水和食物，引起的疾病以腹泻为主要临床症状，呈全球分布，也是艾滋病患者死亡的主要病因之一。免疫功能正常人群感染，常可引起急性、自限性腹泻，婴幼儿、免疫功能缺陷或免疫抑制人群感染，可引起慢性消耗性腹泻，甚至死亡。该类疾病可从动物传播到人，人传播到动物，并在动物与动物、人与人之间广泛传播，造成重大经济影响。每年全球有250万5岁以下的儿童因包括肠道原虫在内的肠道病原体感染引起的腹泻而死亡。我国隐孢子虫感染率0.5％～13.5％，贾第虫为2.52％，环孢子虫为0.3～10.6％，其中临床腹泻患者环孢子虫感染率为1.71～2.47％；上海某医院腹泻患者微孢子虫的感染率高达13.49％。其中隐孢子虫病已被WHO列入全球六大腹泻病之一，于1986年将隐孢子虫作为AIDS(艾滋病)患者的一项怀疑指标，并被WHO和美国CDC列入新发传染病，隐孢子虫病越来越引起关注，已被列为美国政府生物恐怖制剂名单的第三位(http://www.nsf.org/consumer/bioterrorism/bioterrorism_agents.asp)，也是其中唯一一种寄生虫病原。隐孢子虫、环孢子虫是美国FoodNet食源性疾病监测十大病原之一，位列第二和第九位；而隐孢子虫和贾第虫是我国《生活饮用水卫生标准》水质必检指标之一，也是我国国家科技重大专项——国家传染病监测技术平台监测的病原。另外，2013年春夏之交，美国暴发了因食物污染引起的环孢子虫病，遍布25个州643人感染；且90％以上的环孢子虫感染与食物污染有关。有资料显示水中只要含有1个卵囊就可引起隐孢子虫病传播流行。但是国内由于对其研究起步较晚，基本仍采用形态学检测，易漏检、误检。快速检测工具的缺乏，无检测试剂盒，更无高通量检测技术，严重制约了对这类新发肠道原虫的监测和研究。随着分子生物学技术的发展，基于不同的分子标识，可实现对该类肠道原虫的检测和鉴定。但单一虫种检测，成本昂贵，费时费力。自1988年Chamberian首次将多重PCR(MultiplexPCR)技术用于人的杜氏营养不良症(DMD)的检测，现已用于传染病的检测。目前，应用多重PCR技术对感染性疾病病原检测主要有两个方向：一是针对每一种病原的单个特异基因进行多重检测，可同时检测一种或几种病原体是否存在；二是针对某一病原的多个基因进行多重检测，可以减少假阳性结果的出现。Lee等建立了一种检测水中隐孢子虫，微孢子虫和环孢子虫的多重PCR检测方法(Lee,S.H,Joung,M,Yoon,S,etal.MultiplexPCRdetectionofwaterborneintestinalprotozoa:microsporidia,Cyclospora,andCryptosporidium.KoreanJParasitol,2010,48(4):297-301)，该方法的最低检出率是10-100个卵囊或子孢子；Li等建立了用于检测隐孢子虫和贾第虫的两重PCR方法(LiW,ZhangN,Gong,P,etal.AnovelmultiplexPCRcoupledwithLuminexassayforthesimultaneousdetectionofCryptosporidiumspp.,CryptosporidiumparvumandGiardiaduodenalis.VetParasitol,2010,173(1-2):11-18)，并与Luminex液相芯片检测技术相结合，并能检测出微小隐孢子虫，该方法的敏感性可检测至5*10-6ngDNA(即0.1个卵囊/包囊)。目前尚无同时检测粪便样本中隐孢子虫、微孢子虫，环孢子虫和贾第虫四种原虫的多重PCR方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一在于提供一种多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒。本专利技术以隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫四种原虫为研究对象，建立了一种快速，敏感，特异的检测试剂盒。本专利技术要解决的技术问题之二在于提供一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫四种原虫的多重PCR检测方法。四种肠道原虫多重PCR方法的建立，解决了进行多次PCR检测的繁琐步骤，一次反应可以达到同时检测多个基因，明确病原体的作用，大大减轻了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本，具备更大的发展趋势。本专利技术是通过以下技术方案实现的：在本专利技术的一方面，提供一种多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒，其用于同时检测隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫，该试剂盒包括如下引物：隐孢子虫的特异性引物：Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQIDNO.1；Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQIDNO.2；贾第虫的特异性引物：Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQIDNO.3；Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQIDNO.4；环孢子虫的特异性引物：Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQIDNO.5；Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQIDNO.6；微孢子虫的特异性引物：Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQIDNO.7；Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQIDNO.8。在本专利技术的另一方面，提供一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的多重PCR检测方法，具体步骤包括如下:(1)隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的虫体DNA提取；(2)引物设计与筛选；所述设计的引物序列为：隐孢子虫的特异性引物：Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQIDNO.1；Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQIDNO.2；贾第虫的特异性引物：Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQIDNO.3；Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQIDNO.4；环孢子虫的特异性引物：Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQIDNO.5；Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQIDNO.6；微孢子虫的特异性引物：M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒，其特征在于，其用于同时检测隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫，该试剂盒包括如下引物：隐孢子虫的特异性引物：Cry‑F：5’‑TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG‑3’，SEQ ID NO.1；Cry‑R：5’‑CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT‑3’，SEQ ID NO.2；贾第虫的特异性引物：Gia‑F：5’‑AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG‑3’，SEQ ID NO.3；Gia‑R：5’‑GCACGCTTAGCCTTCTTGGC‑3’，SEQ ID NO.4；环孢子虫的特异性引物：Cycl‑F：5’‑GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA‑3’，SEQ ID NO.5；Cycl‑R：5’‑CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT‑3’，SEQ ID NO.6；微孢子虫的特异性引物：Micro‑F：5’‑ACGGAGGCGAAGGCGACACT‑3’，SEQ ID NO.7；Micro‑R：5’‑CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG‑3’，SEQ ID NO.8。

【技术特征摘要】
1.一种多重PCR检测肠道新发原虫试剂盒，其特征在于，其用于同时检测隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫，该试剂盒包括如下引物：隐孢子虫的特异性引物：Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQIDNO.1；Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQIDNO.2；贾第虫的特异性引物：Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQIDNO.3；Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQIDNO.4；环孢子虫的特异性引物：Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQIDNO.5；Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQIDNO.6；微孢子虫的特异性引物：Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQIDNO.7；Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQIDNO.8。2.一种隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的多重PCR检测方法，所述方法不包括疾病诊断和治疗方法，其特征在于，具体步骤包括如下:(1)隐孢子虫、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫的虫体DNA提取；(2)引物设计与筛选；所述设计的引物序列为：隐孢子虫的特异性引物：Cry-F：5’-TCAGCTTTAGACGGTAGGGTATTGG-3’，SEQIDNO.1；Cry-R：5’-CGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTT-3’，SEQIDNO.2；贾第虫的特异性引物：Gia-F：5’-AGTGTTGAGATGCTTCAGGACATG-3’，SEQIDNO.3；Gia-R：5’-GCACGCTTAGCCTTCTTGGC-3’，SEQIDNO.4；环孢子虫的特异性引物：Cycl-F：5’-GACAGTTGGGGGCATTCGTATTTA-3’，SEQIDNO.5；Cycl-R：5’-CCCCCAGAACCCAGAGACTTTGAT-3’，SEQIDNO.6；微孢子虫的特异性引物：Micro-F：5’-ACGGAGGCGAAGGCGACACT-3’，SEQIDNO.7；Micro-R：5’-CTTGCGAGCGTACTATCCCCAGAG-3’，SEQIDNO.8；(3)质粒构建；(4)建立多重PCR方法，对所设计的引物进行PCR反应条件优化，得到最佳多重PCR模式；(5)按照步骤(4)的PCR反应条件进行PCR扩增特异性验...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉娟，曹建平，刘华，袁忠英，姜岩岩，尹建海，王燕娟，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：上海;31