本发明专利技术公开了可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对CMTM3基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，检测效率高，针对性强，同时，以CMTM3基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种辅助诊断大肠癌的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与大 肠癌相关的OfTM堪因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
技术介绍
大肠癌（Colorectal Cancer，CRC)又称结直肠癌，是消化系统中常见的恶性肿瘤。 目前研宄表明大肠癌是大肠黏膜上皮细胞在遗传和环境等多种复杂的因素共同作用下，发 生遗传和表观遗传的改变而获得无限增殖，躲避凋亡程序等能力，从而在局部形成肿块。近 年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯与结构的改变，加之人口老龄化趋势的影响，我 国大肠癌的发病率和死亡率增长迅速，而且发病年龄明显提前。世界卫生组织（WHO)发布 的《全球癌症报告2014》显示中国癌症新增病例和死亡人数的绝对数值位居世界首位。其 中以胃癌、食道癌、大肠癌为代表的消化道癌症威胁最为显著。尽管目前手术方式和辅助治 疗手段不断改进，大肠癌的患者的术后生存情况有了较大的改善，但是CRC患者的五年总 体生存率仍旧不高，其中最重要的一个因素就是，许多患者在疾病发生的早期没有得到及 时的诊断和治疗。因此，有必要探索其他分子指标独立或者联合CEA等检测，对大肠癌患者 做到早发现，早诊断，早治疗，提高大肠癌患者总体生存率。 趋化素样因子超家族成员 3 (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3，OiTM?)是趋化素样因子超家族（Chemokine-Like Factor Family，OZ/^F)中的一员。趋化素样因子超家族成员3是由位于16号染色体的趋化素样 因子超家族成员 3 基因（CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3，Oi713)(chrl6:66,637,935-66,647,795)编码而成的。国内外已有大量研宄报 道了趋化素样因子超家族成员 3 (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3, OiTM?)能通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤的生长，并且也阐明趋化素样因子 超家族成员 3 (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing family member 3, OiTM?)启动子区高甲基化的表观遗传修饰与消化系统肿瘤发病的关系。但是大部分研宄均 是对甲基化定性检测方法，灵敏性特异性均较低。目前，国内外还没有公开任何关于用于定 量检测大肠癌中趋化素样因子超家族成员3基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关 研宄报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测方便、针对性强、检测准确率高的可 用于检测与大肠癌相关的OiTM堪因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，其中基因 OiTM?甲基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，可通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊 断大肠癌。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与大肠癌相关的 OiTM堪因启动子区甲基化程度的试剂盒，包括OiTM堪因启动子区的甲基化特异性扩增 上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5? -Biotin -AGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA-3?； 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' -CCACCTTCTTCTTCACCCTAAT-3' ； 所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' -CTTCTTCTTCACCCTAATT-3'。 一种可用于检测与大肠癌相关的〇?ΤΜ5基因启动子区甲基化程度的试剂盒的应 用，该试剂盒可用于大肠癌辅助检测、诊断或药物治疗中。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了可用于检测与大肠癌相 关的OiTM堪因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含趋化素样 因子超家族成员3基因启动子区的甲基化特异性上游引物、甲基化特异性下游引物及其甲 基化特异性测序引物。趋化素样因子超家族成员3基因启动子区域的高甲基化，影响转录 因子与DNA间的相互作用，或改变染色质结构从而导致趋化素样因子超家族成员3基因的 低表达，从而影响大肠癌的发生和发展。因此，趋化素样因子超家族成员3基因启动子区甲 基化水平与大肠癌的患病率呈正相关，通过检测趋化素样因子超家族成员3基因启动子区 甲基化程度辅助诊断大肠癌，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速 和经济节约的优点，有利于大肠癌的早期发现和及时治疗。 综上所述，以基因 OiTM?启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快 捷地在分子水平上实现对大肠癌的检测，同时，以堪因启动子区域DNA甲基化为靶点 的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。【附图说明】 图1为被检测序列所在区域(具体位置为chrl6:66, 638, 384-66, 638, 441)，以及 所检测的7个CpG点之间的关联性分析结果(例如CpGl与CpG2的相关系数为0. 842,CpG2 与CpG3的相关系数为0. 933); 图2为DNA甲基化水平检测结果示意图（如图示CpGl到CpG7的甲基化程度分别为49%， 46%，51%，46%，42%，49%，42%);图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点 附近碱基种类可分析得到其甲基化水平（即阴影框对应的上方数字)。【具体实施方式】 以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。 具体实施例 1、研宄对象的收集 本研宄选取宁波市某三甲医院手术切除的大肠癌患者42例手术标本作为研宄对象。 所有病例诊断，依据患者的临床资料、影像学和结肠镜检查等，并得到术后病理诊断确认。 手术切除大肠癌组织和癌旁组织(距离癌组织至少5cm以上的正常组织)立即保存于-80度 液氮，用于日后组织标本全基因组DNA提取。所有研宄对象都签署知情同意书。 2、基因组DNA的提取 采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden,德国）DNA提取试剂盒提取组织全基因 组DNA，再通过NanoDr当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可用于检测与大肠癌相关的CMTM3基因启动子区甲基化程度的试剂盒，其特征在于包括CMTM3基因启动子区的甲基化特异性扩增上游引物、下游引物及其甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’‑Biotin ‑AGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA‑3’；所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’‑CCACCTTCTTCTTCACCCTAAT‑3’；所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’‑CTTCTTCTTCACCCTAATT‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：段世伟，叶孟，李锦芸，陈成，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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