大肠癌特异性抗原肽及大肠癌检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种大肠癌特异性抗原肽、大肠癌特异性抗原肽的表达载体以及制备方法，包含表达载体的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及其操作方法。利用噬菌体将大肠癌cDNA文库展示到噬菌体表面，并经亲和筛选和血清学分析从中筛选出大肠癌特异性抗原肽的表达载体，作为主要组分，与阴性对照、酶标板、显色剂及终止液等构成检测试剂盒。本发明专利技术的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，有效表达大肠癌特异性抗原肽，包被在酶标板上，具有检测大肠癌病人血清中由于肿瘤刺激所产生的自身抗体的能力，从而达到早期检测和筛选大肠癌病人的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医用检测试剂
，涉及一种大肠癌特异性抗原肽的表达载体及构建方法、大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及操作方法。
技术介绍
大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率位于第三，在我国则有逐年上升的趋势，在上海已位居恶性肿瘤发病率第二位。根据中国卫生部卫生信息2007年统计数据表明，发病率占全部恶性肿瘤的第3位，大肠癌死亡率为10.25 / 10万，占癌症致死第5位。大肠癌根据1匪分期不同可分为I、II、III、IV期，各期大肠癌预后相差很大，早期大肠 癌复发及转移率低，预后良好，术后5年生存率可达97%，进展期大肠癌术后5年生存率仅为40%-50%。因此探索大肠癌早期诊断和筛查方法非常重要。目前常用的大肠癌检查方法有直肠指诊、粪便隐血实验、结肠镜及影像学检查。而这些检查都存在有不足之处，直肠指诊范围局限，粪隐血实验敏感性及特异性差，结肠镜检查有一定痛苦，患者较难接受，影像学检查对于早期肿瘤不敏感。目前常用的肿瘤标志物如癌胚抗原(CEA)，CA19-9等指标缺乏敏感性及特异性，不能对大肠癌进行早期诊断。因此建立能高通量诊断大肠癌的特异检查方法是当务之急。
技术实现思路
肿瘤发生后，肿瘤细胞表面的特征抗原或肿瘤细胞分泌的特征抗原刺激机体产生抗体，这些抗体可存在于尚无症状的早期肿瘤患者血清中。通过寻找大肠癌特征抗原，利用它来检测患者血清中的特异性自身抗体，从而做为分子标志，可以早期发现大肠癌，与现行的其他方法相比，具有微创、简单、经济、敏感度及特异度高等特点，方便用于社区人群的筛查，从而达到早期检测大肠癌的目的。本专利技术的第一个目的在于提供一种大肠癌特异性抗原肽，利用它来检测患者血清中的特异性自身抗体，从而作为分子标志来早期发现大肠癌。本专利技术的第二个目的在于提供一种大肠癌特异性抗原肽的表达载体。本专利技术的第三个目的在于提供该表达载体的构建方法。本专利技术的第四个目的在于提供包含表达载体的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒，用于检测早期大肠癌。本专利技术的第五个目的在于提供该试剂盒的制备及其操作方法。本专利技术提供的大肠癌特异性抗原肽，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8，或 SEQ ID No. 10 所示。本专利技术提供的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，由噬菌体和编码大肠癌特异性抗原肽的cDNA片段构成，所述cDNA片段的序列如SEQ ID No. USEQ ID No. 3,SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7或SEQ ID No. 9所示。优选的，所述噬菌体为17噬菌体。本专利技术提供的大肠癌特异性抗原肽表达载体的构建方法，包括a)构建大肠癌噬菌体展示肽库抽提30例新鲜大肠癌组织总RNA,等量混合成Img后抽提mRNA,应用ol igo dT引物反转录为cDNA，将cDNA末端进行平齐，加Ecol I和Hind III接头，双酶切后去除小片断，然后接入17噬菌体双臂，进行体外包装，构建大肠癌噬菌体展示肽库；b)亲和筛选大肠癌特异抗原肽取10 ill A/G的琼脂糖珠置于一 1.5ml离心管中，用pH7. 4的500 ill PBS洗2次，1%BSA4°C封闭Ih，琼脂糖珠分别与15iU大肠癌患者及对照患者的血浆4 °C孵育过夜，500 u I PBS洗涤3次后，用10 ill PBS溶解富集到的抗体，10管大肠癌的抗体及10管非大肠癌的抗体各自合并成一管，取所述噬菌体展示肽库扩增液20iU，先与20iU的非大肠癌抗体孵育lh，未结合的上清再与20 Ul大肠癌抗体结合，保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体， 并用IOOiU 1%SDS洗脱，将其转染细菌至扩增，完成一轮亲和筛选，重复上述步骤，反复进行五轮亲和筛选；c)血清学筛选大肠癌早期检测分子标志Cl)混合血样初筛筛选后得到的噬菌体展示肽库用LB液体培养基I: IO8稀释后，取100 U I噬菌体液、250 u I新摇好的BLT5403细菌，3ml保温55°C的顶层琼脂，混匀后立刻倒入铺有LB的平皿中，冷却后，37°C温箱孵育4小时，可见有单个的噬菌斑形成，每I个I. 5ml离心管中，加入Iml新摇好的细菌BLT5403，随机挑取单个的、边界清晰的噬菌体于I个I. 5ml离心管中，共随机挑选噬菌体克隆2000个，并按顺序编号，挑好的噬菌体置37°C恒温振荡器摇4小时以上，直至每一管液体均变澄清为止，挑选好的噬菌体克隆置4°C保存，用T7引物进行PCR反应，扩增所挑选噬菌体克隆的插入片段，挑取扩增片段200bp以上的噬菌体克隆进行ELISA实验进一步筛选；所述ELISA实验的步骤为将T7 TAILER抗体用pH7. 4的PBS按I :1000来稀释，每孔取100 ill包被于96孔酶标板，4°C摇床轻摇过夜；用洗液洗板，每孔300 ii I，洗四次，每次约I分钟，拍干；采用200ii 12% BSA/PBS于26°C封闭2小时；用洗液洗板，每孔300 U 1，洗四次，每次约I分钟，拍干；加入用1%BSA以I :5比例稀释的噬菌体100 iil，每个标本加4孔；每次试验均加入没有插入片段的空噬菌体作为阴性对照4孔和空白对照2孔，室温孵育2小时，弃去孔内液体，拍干；每个噬菌体标本加入100 U I 1%BSA以I :500比例稀释的大肠癌组混合血浆、对照组混合血浆各2孔，所用大肠癌组、对照组的混合血浆的患者信息同步骤b)亲和筛选所用的患者，室温孵育I小时；洗板后每孔加入IOOiU I :10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，于26°C室温孵育I小时；洗板后每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各2滴，混匀后，37°C孵育5分钟，加入终止液25 yl，立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白孔调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果，每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值> 2. 0，判断为阳性结果；样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值〈2. 0，判断为阴性结果；找出与大肠癌混合血清反应为阳性，而与对照混合血清反应为阴性的有意义的噬菌体克隆；c2)独立血清复筛将经步骤Cl)初筛后的所述有意义的噬菌体应用30例大肠癌患者血清及30例健康对照血清进行ELISA复筛，步骤同Cl中所述ELISA实验的步骤，不同之处在于筛选所用的血清为独立的，而不是混合血清，对比所述有意义的噬菌体与各大肠癌患者血清及对照血清的反应性，应用独立样本t检验的方法，挑选出与30例大肠癌血清及30例健康对照血清的反应数据具有显著差异的噬菌体克隆；c3)大肠癌特异性抗原肽重组载体的诊断模块的获得 应用dige R软件采用随机森林法对所有独立血清样本进行2000次随机抽样，根据各噬菌体肽区分大肠癌血清的能力，对步骤c2所得到的具有显著差异的噬菌体的筛选 能力从高到低进行排序；采用贝叶斯双变量模型，依次检验噬菌体联合检测的效果，按联合数量最少、且联合检测的灵敏度与特异性与步骤c2所得到的具有显著差异的噬菌体联合检测的灵敏度与特异性最接近的标准，得到5个大肠癌特异性抗原肽的表达载体，其上插入的 cDNA 片段的序列如 SEQ ID No. I、SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠癌特异性抗原肽，其特征在于，所述大肠癌特异性抗原肽的氨基酸序列如SEQ？ID？No.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种大肠癌特异性抗原肽，其特征在于，所述大肠癌特异性抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 6 所示。2.一种用于表达权利要求I所述的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，其特征在于，由噬菌体和编码大肠癌特异性抗原肽的cDNA片段构成，所述cDNA片段的序列如SEQ ID No. 5所示。3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述噬菌体为T7噬菌体。4.一种大肠癌特异性抗原肽表达载体的构建方法，其特征在于，包括 a)构建大肠癌噬菌体展示肽库 抽提30例新鲜大肠癌组织总RNA,等量混合成Img后抽提mRNA,应用oligo dT引物反转录为cDNA，将cDNA末端进行平齐，加Ecol I和Hind III接头，双酶切后去除小片断，然后接入T7噬菌体双臂，进行体外包装，构建大肠癌噬菌体展示肽库； b)亲和筛选大肠癌特异抗原肽 取IOiU A/G的琼脂糖珠置于一 1.5ml离心管中，用500 ill pH7. 4的PBS洗2次，1%BSA4°C封闭lh，琼脂糖珠分别与15iU大肠癌患者及对照患者的血浆4°C孵育过夜，500 u I PBS洗涤3次后，用IOiU PBS溶解富集到的抗体，10管大肠癌的抗体及10管非大肠癌的抗体各自合并成一管，取所述噬菌体展示肽库扩增液20iU，先与20iU的非大肠癌抗体孵育lh，未结合的上清再与20 Ul大肠癌抗体结合，保留结合到琼脂糖珠上的噬菌体，并用100 u 11%SDS洗脱，将其转染细菌至扩增，完成一轮亲和筛选，重复上述步骤，反复进行五轮亲和筛选； c)血清学筛选大肠癌早期检测分子标志 cl)混合血样初筛 筛选后得到的噬菌体展示肽库用LB液体培养基I: IO8稀释后，取100 ill噬菌体液、250 u I新摇好的BLT5403细菌，3ml保温55°C的顶层琼脂，混匀后立刻倒入铺有LB的平皿中，冷却后，37°C温箱孵育4小时，可见有单个的噬菌斑形成，每I个I. 5ml离心管中，加入Iml新摇好的细菌BLT5403，随机挑取单个的、边界清晰的噬菌体克隆于I个I. 5ml离心管中，共随机挑选噬菌体克隆2000个，并按顺序编号，挑好的噬菌体置37°C恒温振荡器摇4小时以上，直至每一管液体均变澄清为止，挑选好的噬菌体克隆置4°C保存，用T7引物进行PCR反应，扩增所挑选噬菌体克隆的插入片段，挑取扩增片段200bp以上的噬菌体克隆进行ELISA实验进一步筛选； 所述ELISA实验的步骤为 将I7TAILER抗体用pH7. 4的PBS按I :1000来稀释，每孔取100 U I包被于96孔酶标板，4°C摇床轻摇过夜； 用洗液洗板，每孔300 iil，洗四次，每次约I分钟，拍干；采用200 u 12%BSA/PBS于26 °C封闭2小时； 用洗液洗板，每孔300 yl，洗四次，每次约I分钟，拍干；加入用1%BSA以I :5比例稀释的噬菌体IOOii 1，每个标本加4孔；每次试验均加入没有插入片段的空噬菌体作为阴性对照4孔和空白对照2孔，室温孵育2小时，弃去孔内液体，拍干； 每个噬菌体标本加入100iUl%BSA以I :500比例稀释的大肠癌组混合血浆、对照组混合血浆各2孔，所用大肠癌组、对照组的混合血浆的患者信息同步骤b)亲和筛选所用的患者，室温孵育I小时； 洗板后每孔加入IOOiIll 10000稀释的HRP耦联的山羊抗人IgG，于26 °C室温孵育I小时； 洗板后每孔加入温度平衡至室温的显色剂A、B各2滴，混匀后，37°C孵育5分钟，加入终止液25 u I，立刻用酶标仪检测，取波长450nm，先用空白孔调零，然后读取各孔的OD值，并记录结果，每次进行ELISA按下列公式计算并判断结果样品平均OD值/阴性对照平均OD值，比值> 2. 0，判断为阳性结果；样品平均OD值/...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹广文，傅传刚，常文军，吴玲玲，曹付傲，刘岩，高显华，李小攀，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：