人宫颈癌细胞特异性结合的多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及人宫颈癌细胞SiHa特异性结合的多肽及其应用，所涉及多肽的氨基酸序列为：QQLKDPWHSTPY。所涉及的应用为本发明专利技术的人宫颈癌细胞SiHa特异性结合的多肽特异结合人宫颈癌的应用。本发明专利技术筛选和初步鉴定获得的宫颈癌靶向多肽具有明显的宫颈癌细胞结合特异性，可用于研发宫颈癌早期靶向诊断试剂、高效低毒靶向治疗药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，以改良的肽库消减筛选法筛选对人宫颈癌细胞(SiHa细胞)特异性结合的多肽(序列)，对人宫颈癌细胞具有良好的结合特异性和敏感性。技术背景宫颈癌(Cervicalcancer)是常见的妇科肿瘤之一，其发病率在发达国家仅次于乳腺癌、子宫内膜癌，在发展中国家则居首位。目前，宫颈癌的治疗主要以手术切除为主，但因早期宫颈癌无明显症状和体征，易造成漏诊或误诊，待发现时已到中晚期，丧失最佳手术时机。放疗、化疗毒性极大，易产生剂量依赖性和药物抗药性等，效果不理想，病人的五年生存率仍然很低。因此，寻找一种敏感性高且特异性强的早期筛查诊断方法，从而降低宫颈癌的死亡率也是目前面临的关键问题之一。近年来，迅速发展的分子影像学与靶向治疗为宫颈癌的治疗带来了新的希望，其中，筛选出宫颈癌细胞表面特异性强、敏感度高的靶向分子成为当务之急。噬菌体肽库技术为宫颈癌细胞靶向分子筛选、宫颈癌的早期诊断和靶向治疗提供了新的途径，其中的关键元件是对癌细胞、癌组织具有特异靶向结合活性的多肽片段的获得。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供以改良的肽库消减筛选由噬菌体12肽库筛选得到对宫颈癌细胞特异性结合的多肽序列，并提供鉴定该多肽与宫颈癌细胞特异性亲和力的实验结果，证明该多肽在宫颈癌的早期分子影像学诊断、靶向化疗、与其它材料偶联而进行的宫颈癌靶向治疗等方面具有巨大应用价值。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：宫颈癌SiHa细胞特异性结合的多肽，其氨基酸序列为：QQLKDPWHSTPY。该多肽能够特异性结合SiHa细胞，而不识别人胚肾HEK293细胞(即正常细胞)，并对其他肿瘤细胞表现出极低的亲和力或者无亲和力。上述宫颈癌SiHa细胞特异性结合的多肽的筛选方法为以体外培养的SiHa细胞系为靶细胞，以人胚肾HEK293细胞系为非特异性吸附细胞，对噬菌体随机12肽库进行4轮消减筛选，随机挑取60个噬菌体克隆，利用ELISA鉴定出阳性克隆。对阳性克隆进行DNA测序，分析其多肽的氨基酸序列组成及基本特征，最后获得拥有共有序列(Consensussequence)的阳性克隆组6个，对它们以细胞免疫荧光法进一步鉴定其特异性和敏感性，确定最佳序列。各种噬菌体克隆水平、最佳序列合成肽探针水平的实验结果均提示序列QQLKDPWHSTPY特异性、敏感性最佳，这为该多肽未来用于宫颈癌的早期分子影像学诊断、靶向化疗等提供了实验依据。由于多肽分子量小、免疫原性低、亲和力高、组织穿透性强、易合成等特点也有望使其与适当的荧光标记物、纳米颗粒、脂质体或抗肿瘤药物等偶联，从而应用于肿瘤的早期影像诊断、靶向治疗、病程监测及肿瘤治疗疗效评价等，对于解决目前癌症防治所面临问题具有重要的意义。本专利技术以宫颈癌SiHa细胞为靶细胞，对噬菌体12肽库以我们改良的消减筛选法进行了4轮消减筛选，最后获得6条共同多肽序列，分别为KNLTNEPQVPLV、ETLPQNESKIPW、QQLKDPWHSTPY、VTALRKVDHTPL、SLSEWQDVRTTS、TITSKLVKWSRK。通过一系列鉴定分析实验发现其中的QQLKDPWHSTPY对于宫颈癌的靶向性最强，提示了其用于宫颈癌诊断、靶向治疗方面的价值。在宫颈癌检测方面，利用同位素或者荧光标记的多肽可以特异性结合宫颈癌细胞/组织，适用于肿瘤成像和分子影像诊断，对于宫颈癌早期检测、癌病灶定位和疗效评价都具有重要意义；在宫颈癌靶向治疗方面，有望利用其特异性高、分子量小、穿透力强、亲和力高的特性来与化疗药物偶联，达到靶向递送给药的目的，可大大减小化疗药物的非特异性和毒副作用。附图说明图1为本专利技术多肽的制备路线图；图2为随机十二肽pIII融合蛋白的N末端序列；图3为专用密码子表；图4为首次ELISA所选36个阳性噬菌体克隆与SiHa细胞亲和力的再鉴定结果；图5为6条共有序列的代表性阳性噬菌体克隆与细胞亲和力的免疫荧光鉴定，其中A:S6+SiHa；B:S6+Hek293；C：S7+SiHa；D：S7+Hek293；E：S21+SiHa；F：S21+Hek293；G：S22+SiHa；H：S22+Hek293；I：S31+SiHa；J：S31+Hek293；K：S46+SiHa；L：S46+Hek293；M：URPs+SiHa；N：PBS+SiHa；DAPI染细胞核；图6为克隆S7(QQLKDPWHSTPY)与靶细胞亲和力鉴定，其中A：SiHa+S7；B：Hek293+S7；C：SiHa+URP；D：Hek293+URP；E：SiHa+PBS；F：Hek293+PBS；DAPI染细胞核；图7为细胞免疫化学鉴定阳性噬菌体克隆S7与靶细胞的结合特异性，其中A：SiHa+S7；B：SiHa+URP；C：SiHa+PBS；D：Hek293+S7；E：Hek293+URP；F：Hek293+PBS；图8为阳性噬菌体克隆S7与多种肿瘤细胞的结合特异性，其中A：S7+SiHa；B：S7+SMMC-7721(肝癌细胞)；C：S7+MCF-7(乳腺癌细胞)；D：S7+Caco-2(结直肠癌细胞)；E：S7+Hek293；F：PBS+SiHa；G：URPs+SiHa；DAPI染细胞核；图9为合成多肽(QQLKDPWHSTPY)与靶细胞特异性结合剂量、时间效应，其中左侧为剂量效应检测，右侧为时间效应检测；图10为合成多肽(QQLKDPWHSTPY)与靶细胞的结合特异性鉴定，其中A：SiHa+阳性多肽；B：SiHa+阴性多肽；C：Hek293+阳性多肽；D：Hek293+阴性多肽；DAPI染细胞核；图11为合成多肽(QQLKDPWHSTPY)在靶细胞定位分析，其中A：SiHa+阳性多肽；B：SiHa+阴性多肽；C：Hek293+阳性多肽；D：Hek293+阴性多肽；DAPI染细胞核；图12为细胞免疫荧光鉴定合成多肽(QQLKDPWHSTPY)与多种肿瘤细胞的结合特异性，其中A：SiHa；B：SMMC-7721(肝癌细胞)；C：MCF-7(乳腺癌细胞)；D：Eca-109(食道癌细胞)；E：Caco2(结直肠癌细胞)；F：SGC-7901(胃癌细胞)；DAPI染细胞核。以下结合附图和具体实例对本专利技术作进一步说明。具体实施方式噬菌体展示技术是1985年由美国Missouri大学的G.P.Smith等创立的一项能够特异性筛选多肽或蛋白的技术。该技术将目的基因编本文档来自技高网...

【技术保护点】
人宫颈癌细胞特异性结合的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列为：QQLKDPWHSTPY。

【技术特征摘要】
1.人宫颈癌细胞特异性结合的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列
为：QQLKDPWHSTPY。
2....

【专利技术属性】
技术研发人员：侯颖春，何慧敏，肖丽，高晓杰，薛琴琴，达苗苗，马乐乐，马妮，程思楠，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61