本发明专利技术属于生物化学及分子免疫学领域，公开了针对GPR45多克隆抗体的特异性抗原肽及其制备与应用。本发明专利技术所述抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示或其保守性变异多肽。本发明专利技术制备的特异性针对GPR45的多克隆抗体不与GPCRs家族中的其他成员发生交叉反应；本发明专利技术的一个优选例中采用原核表达系统获得抗原，并且抗原携带有6XHis标签的技术方案，使产物易于纯化。本发明专利技术所提供的制备方法简单，制备的抗体免疫原性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化学及分子免疫学领域，主要涉及了一种针对GPR45多克隆抗体的特异性抗原，并公开了所述抗原肽的制备及其在GPR45多克隆抗体制备中的应用。
技术介绍
G蛋白偶联受体(GPCR)是成员最多的膜蛋白家族，人基因组就有约800种GPCR。GPCR在多种生命活动过程中扮演关键角色，它们接受激素、神经递质、离子和光子等各种外界信号，通过与G蛋白、arrestin、JAK等不同的互作蛋白，对细胞内第二信使和不同基因转录进行调节。GPCR也是重要的候选药物靶标，市售药物中超过30％作用于GPCR信号系统。GPR45是一个未知功能和配体的“孤儿”受体，其功能和组织细胞定位仍有待深入研究。抗体是蛋白表达和功能研究的重要工具，在识别蛋白组织和细胞内定位，了解蛋白功能和相互作用，调节蛋白活性等方面用途广泛。目前，市售GPR45抗体都是利用人GPR45的一小段氨基酸序列作为抗原。我们尝试过四个公司的GPR45的抗体，所得到的结果均不理想：从Abgent公司购买的GPR45抗体，所述抗体的抗原表位是人GPR45第121-149位氨基酸，细胞染色结果显示其不能特异识别GPR45蛋白。从Abcam公司购买的GPR45抗体，所述抗体的抗原表位是人GPR45第三胞内域的16个氨基酸，细胞染色结果显示其检测不到GPR45过表达信号。从SantaCruz公司购买的GPR45抗体，抗原表位是人GPR45某胞内肽段，细胞染色结果显示其检测不到GPR45过表达信号。从Gentex公司购买的GPR45抗体，所述抗体的抗原表位是人GPR45第174-237位氨基酸，细胞染色结果显示其可以检测到GPR45过表达的信号，但小鼠组织染色结果显示其信号微弱，且在野生型小鼠和GPR45表达被破坏的GPR45突变小鼠体内均能够检测信号，表明抗体特异性较差。
技术实现思路
为克服现有技术中的不足，本专利技术的目的在于提供一种针对GPR45多克隆抗体的特异性抗原及其多克隆抗体的制备方法。本专利技术制备的GPR45多克隆抗体不与GPR45相似度极高的抗原发生交叉反应，也不与GPCRs家族中的其他成员发生交叉反应。本专利技术通过原核表达系统获得抗原，并且抗原携带有6XHis标签，易于纯化；本专利技术克服了现有多肽免疫原性差、价格昂贵的缺点，同时也具备极高的特异性。本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术的第一方面提供了一种分离的抗原肽，所述抗原肽为氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的多肽或其保守性变异多肽。本专利技术的第二方面提供了一种融合蛋白，含有所述抗原肽与标签蛋白，可以是所述抗原肽与标签蛋白的融合蛋白。优选地，所述标签蛋白选自：6XHis、GST、FLAG、MAP(multipleantigenicpeptide)、钥孔血蓝蛋白(KLH)。本专利技术的优选实施例具体列举了氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的多肽与6XHis的融合蛋白。本专利技术第三方面提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码所述抗原肽或融合蛋白。优选的，编码所述抗原肽的多核苷酸的碱基序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术第四方面提供了一种载体，含有所述多核苷酸。优选的，所述载体选自：pET30a、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-41c(+)、pET-42a(+)、pET-42b(+)、pET-42c(+)。本专利技术的第五方面提供了一种工程菌，含有所述载体。优选的，所述工程菌选自原核表达菌株。更优选的，所述原核表达菌株选自：BL21(DE3)、Rosetta2、Origami2、Rosetta-gami2、OrigamiB等菌株。更优选的，所述原核表达菌株为BL21(DE3)。本专利技术第六方面提供了所述抗原肽或融合蛋白的制备方法：选自以下任一：(1)利用化学合成方法合成所述抗原肽；(2)在合适的条件下培养所述工程菌并使其表达所述抗原肽或融合蛋白，而后分离及纯化获得所述抗原肽或融合蛋白。本专利技术的第七方面提供了所述抗原肽或融合蛋白用于制备特异性针对GPR45的多克隆抗体的用途。本专利技术的第八方面提供了一种多克隆抗体，为以所述的抗原肽或融合蛋白为抗原制得。优选的，所述多克隆抗体为采用本专利技术的抗原肽或融合蛋白作为免疫抗原免疫动物获得。本专利技术的第九方面提供了所述的多克隆抗体在制备检测GPR45的药物或制剂中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术GPR45抗原的选择：去除了GPR45氨基酸序列中所有疏水(跨膜)肽段、与GPR63高度同源的第一胞外区和部分第二胞外区、以及第一和第二胞内区，最终用于免疫豚鼠的抗原决表位编码核苷酸序列。所制备的GPR45抗体的优势：灵敏度高，特异性强，可以检测到小鼠内源性表达的GPR45。附图说明图1：经过第一步PCR，所获的基因片段，称之为GPRS1，琼脂糖凝胶电泳结果。图2：经过第二步PCR，所获的基因片段，称之为GPRS2，琼脂糖凝胶电泳结果。图3：经过第三步PCR，所获的基因片段，称之为GPRS3，琼脂糖凝胶电泳结果。图4：经过第四步PCR，所获的基因片段，称之为GPR或GPR45目的片段，琼脂糖凝胶电泳结果。图5：阳性克隆1-12，对其提取质粒，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果。图6：克隆1的序列是正确的。图7：在大肠杆菌中经IPTG诱导得到的含有所述融合蛋白6XHis-GPR45的大肠杆菌裂解液的SDS-PAGE结果。图8：获得分子量17KD的抗原片段6.6mg(纯度>90％)。图9：将抗原稀释到0.5ng仍能被抗血清检测到，且2号豚鼠的免疫信号更强，充分说明，所制备的多克隆抗体具有极高的灵敏度。图10：将抗原稀释到0.5ng仍能被抗血清检测到，且2号豚鼠的免疫信号更强，充分说明，所制备的多克隆抗体具有极高的灵敏度。图11：GPR45表达于下丘脑区域，GPR45抗体免疫荧光染色检测GPR45在14日龄小鼠下丘脑区域的表达，GPR45主要表达于野生型小鼠(+/+)下丘脑的视交叉上核(suprachiasmatic,SCN)、下丘脑背内侧核(DMN),下丘脑腹内侧核(VMN)和弓形核(ARC)中，而在GPR45突变纯合子(PB1/PB1)(GPR45表达被抑制)中未检测到明显GPR45信号表达，图中标尺＝0.2mm。图12：从Abgent公司购买的GPR45抗体，所述抗体的抗原表位是人GPR45第121-149位氨基酸，1:50稀释，对293T细胞进行免疫荧光染色，可见非特异性红色信号。图13：从Abcam公司购买的GPR45抗体，所述抗体的抗原表位是人GPR45第三胞内域的16个氨基酸，1:50稀释，对293T细胞进行免疫荧光染色，无GPR45检测信号。图14：从SantaCruz公司购买的GPR45抗体，所述抗体的抗原表位是人GPR45某胞内肽段，1:10稀释，对293T细胞进行免疫荧光染色，无GPR45检测信号。图15：从Gentex公司购买的GPR45抗体，所述抗体的抗原表位是人GPR45第174-237位氨基酸，1:100稀释，对2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的抗原肽，其特征在于，所述抗原肽为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽或其保守性变异多肽。
【技术特征摘要】
1.一种分离的抗原肽，其特征在于，所述抗原肽为氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的多肽或其保守性变异多肽。2.一种分离的融合蛋白，含有权利要求1所述抗原肽与标签蛋白。3.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述标签蛋白选自：6XHis、GST、FLAG、MAP(multipleantigenicpeptide)、钥孔血蓝蛋白(KLH)。4.如权利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的多肽与6XHis的融合蛋白。5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸编码权利要求1所述抗原肽或编码权利要求2-4任一权利要求所述融合蛋白。6.如权利要求5所述的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中，编码所述抗原肽的多核苷酸的碱基序列如SEQIDNO：1所示。7.一种载体，含有权利要求5或6所述多核苷酸。8.如权利要求7所述载体，其特征在于，所述载体选自：pET30a、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-6P-1、pGEX-6P-2、pGEX-6P-3、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-41c(+)、pET-42a(+)...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓晖，许田，韩珉，崔婧，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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