本发明专利技术涉及生物技术和免疫分析技术领域，具体地说是含有与前列腺抗原特异性结合短肽的噬菌体及其应用。所述的含有与前列腺抗原特异性结合短肽的噬菌体单克隆是展示有随机多肽的噬菌体单克隆；所述的前列腺抗原包括游离态的前列腺特异性抗原(free PSA，f‑PSA)、f‑PSA与前列腺特异性抗原‑α1‑抗糜蛋白酶复合物(PSA‑ACT)的和(总PSA,t‑PSA)。所述的含有与前列腺抗原特异性结合短肽的噬菌体可作为探针检测前列腺抗原。所述的检测方法是“噬菌体探针/前列腺抗原/前列腺抗原单克隆抗体”模式的夹心法ELISA前列腺抗原检测方法。本发明专利技术所述的方法灵敏度高、稳定性好、成本低。所述的噬菌体单克隆可作为新型的生物检测探针，在分析化学、检测、免疫反应、生物医学等领域得到广泛的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术和免疫分析
，具体地说是含有与前列腺抗原特异性结合短肽的噬菌体及其应用。
技术介绍
前列腺疾病是男科最常见的疾病，包括前列腺炎、前列腺增生及前列腺癌等，其中前列腺癌是男性癌症患者中最常见的恶性肿瘤之一。随着生活水平的提高以及社会人口老龄化加重，前列腺癌的发病率逐年递增趋势更为明显。因此，前列腺癌早期快速、准确的检测具有十分重要的意义。前列腺癌的主要诊断方法有前列腺特异性抗原系列检测，影像学检查，直肠指检，穿刺活体组织检查等。其中前列腺特异性抗原作为前列腺癌的肿瘤标记物已广泛应用于前列腺癌的早期诊断、疗效评估以及手术治疗的跟踪指标、预后判断等。前列腺抗原(PSA)具有高度组织来源特异性，正常状态下，PSA仅存在于前列腺组织、精液、前列腺液中，血液中PSA含量极低。当前列腺发生炎症或是癌变等病变时，前列腺组织会大量分泌PSA，并使其进入血液中，使血清中PSA含量升高。在血清中，PSA可以与含有丝氨酸蛋白酶抑制基团的的复合物共价结合形成复合物，因此血液中的PSA是以多种分子形态存在的。其中约10％～30％的前列腺特异性抗原以游离态的形式存在，即游离的PSA(freePSA，f-PSA)；约70％～90％的前列腺特异性抗原与内源性蛋白酶抑制物α1-抗糜蛋白酶(α1-antichymotrypsin，ACT)结合形成前列腺特异性抗原-α1-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)。临床上通常以f-PSA与PSA-ACT的和作为总PSA(t-PSA)，代表血清中的PSA水平。确定fPSA/tPSA比值，对前列腺癌的诊断、鉴别以及确定前列腺疾病性质具有非常重要的意义前列腺特异性抗原的传统检测方法主要有放射免疫检定法、免疫放射测定法、化学发光免疫分析法、金标免疫层析法、时间分辨荧光免疫分析法和酶联免疫分析法(ELISA)等。这些检测方法都是基于抗原与单克隆抗体之间的特异性免疫反应，借助于放射标记、化学发光、荧光分析等方法完成检测的。近些年来，为提高前列腺特异性抗原的检测灵敏度，加强前列腺癌的早期诊断，一些新型的PSA检测方法不断被科学家们研究探索，同样是基于抗原与单克隆抗体之间的特异性免疫反应，实现PSA的高灵敏检测。ELISA在免疫分析技术中表现出的高特异性和高灵敏度使其成为肿瘤标记物检测中非常实用的检测工具。基于ELISA试剂盒的PSA检测已经成为一种常规的检测手段。近二十年来，众多学者致力于前列腺抗原高特异性、高灵敏度单克隆抗体的筛选，并应用于ELISA试剂盒的研发。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳结构蛋白基因的特定位置，使外源基因表达产物融合于结构蛋白的N端或C端，随噬菌体的组装而将外源蛋白或多肽展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体展示技术已广泛应用于生物科学技术的各个领域。丝状噬菌体是一类能够感染革兰阴性细菌的细菌病毒，主要包括M13、f1和fd噬菌体。基于噬菌体展示技术构建展示文库，可为诸多蛋白靶分子提供一个丰富的配体筛选资源，目前噬菌体展示文库主要有随机肽库和抗体文库。噬菌体展示随机多肽文库的构建是将特定长度的编码多肽的随机寡核苷酸序列插入到噬菌体基因的特定位点，使特定长度的不同序列的外源多肽展示于噬菌体表面。Petrenko与Smith等人以丝状噬菌体fd-tet为基础，构建出f8/8风景噬菌体文库。将编码随机八肽的寡核苷酸序列取代编码噬菌体pVIII蛋白N端Glu-Gly-Glu(E2-G3-E4)的核酸序列，将随机八肽展示于噬菌体表面。f8/8风景噬菌体文库中含有约3.0×109个展示有不同八肽序列的噬菌体克隆，而每种八肽序列在单一噬菌体的表面有近4000份相同的拷贝。f8/8风景噬菌体克隆应用于免疫分析检测具有很大的优势。噬菌体有极高的效价可以与靶标多价结合，噬菌体的制备简单、快速，特异性噬菌体克隆一经淘选获得后即可无限量培养扩增，成本廉价，噬菌体可经得起严酷的生存环境，在很宽的pH范围内稳定，能经得起核苷酶的处理，具有极好的耐温性，噬菌体在非水溶剂中稳定。鉴于上述众多优点，风景噬菌体作为一种新型的特异性探针应用于ELISA免疫分析领域中，必然具有良好的发展前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供含有与前列腺抗原特异性结合短肽的噬菌体及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种与前列腺抗原特异性结合的短肽，短肽的氨基酸序列F1为ERNSVSPS或F2为ATRSANGM。所述短肽F1特异性识别f-PSA；F2同时识别f-PSA和PSA-ACT，即t-PSA。一种与前列腺抗原特异性结合短肽的筛选方法，以游离态的前列腺抗原作为靶标对噬菌体文库进行生物淘选获得的噬菌体单克隆；而后以肿瘤标记物为靶标，通过噬菌体捕获实验进行特异性结合评价，确定特异性识别前列腺抗原的噬菌体单克隆，展示于该噬菌体单克隆表面的多肽即为前列腺抗原特异性结合的短肽。所述前列腺抗原是游离态的前列腺特异性抗原(freePSA，f-PSA)和f-PSA与前列腺特异性抗原-α1-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)的和(总PSA,t-PSA)。一种与前列腺抗原特异性结合短肽的应用，所述短肽作为前列腺抗原特异性配体探针。所述特异性配体探针用于前列腺抗原的检测。所述短肽作为特异性配体探针采用夹心ELISA法对f-PSA和t-PSA进行相应检测。一种含有与前列腺抗原特异性结合的短肽的噬菌体，噬菌体为含有所述F1或F2短肽的噬菌体单克隆体。所述的噬菌体单克隆是通过以游离态的前列腺抗原作为靶标对噬菌体文库进行生物淘选获得的噬菌体单克隆，具体方法是将f-PSA(MeridianLifeScience)包被于96孔酶标板上，加入噬菌体文库，孵育；洗去没有靶标结合特性的噬菌体，保留具有靶标结合特性的噬菌体；再用弱酸洗脱具有靶标结合特性的噬菌体，感染饥饿细胞进行噬菌体滴度测定，结果作为第一轮淘选特异性噬菌体的输出量。按照上述淘选步骤依次进行第二轮、第三轮生物淘选，测定每一轮淘选的噬菌体文库的输入量、输出量，并计算每一轮淘选的回复率。以f-PSA为靶标进行三轮淘选后，将第三轮洗脱的噬菌体进行梯度稀释，稀释梯度为10-1、10-2、10-3、10-4，然后进行平板涂布，37℃过夜培养。选择合适的噬菌体浓度梯度，使用无菌牙签从过夜培养的平板上随机挑选多个噬菌体单克隆，按照PCR条件进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。鉴定后的PCR产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。运用BioEdit软件对测序序列分析，获取噬菌体表面展示的多肽序列。其中T1展示的八肽序列是ERNSVSPS，T2展示的八肽序列是ATRSANGM。以肿瘤标记物AFP、hK-2、CA125、CA15-3、CA19-9作为对照靶标，通过噬菌体捕获实验进行特异性结合评价，确定特异性识别前列腺抗原的噬菌体单克隆，具体方法是分别以f-PSA、PSA-ACT、AFP、hK-2、CA125、CA15-3、CA19-9包被96孔酶标板(以空白孔作为空白对照)；加入噬菌体单克隆106TU，4℃,16h过夜与之孵育；洗去未被包被抗原捕获的噬菌体，漂洗10次，每次10min，再用弱酸洗去被靶标捕获的噬菌体，经Tris-HCl中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与前列腺抗原特异性结合的短肽，其特征在于：短肽的氨基酸序列F1为ERNSVSPS或F2为ATRSANGM。
【技术特征摘要】
1.一种与前列腺抗原特异性结合的短肽，其特征在于：短肽的氨基酸序列F1为ERNSVSPS或F2为ATRSANGM。2.按权利要求1所述的与前列腺抗原特异性结合的短肽，其特征在于：所述短肽F1特异性识别f-PSA；F2同时识别f-PSA和PSA-ACT，即t-PSA。3.一种权利要求1所述的与前列腺抗原特异性结合短肽的筛选方法，其特征在于：以游离态的前列腺抗原作为靶标对噬菌体文库进行生物淘选获得噬菌体单克隆；而后以肿瘤标记物为靶标，通过噬菌体捕获实验进行特异性结合评价，确定特异性识别前列腺抗原的噬菌体单克隆，展示于该噬菌体单克隆表面的多肽即为前列腺抗原特异性结合的短肽。4.按权利要求3所述的与前列腺抗原特异性结合短肽的筛选方法，其特征在于：所述前列腺抗原是游离态的前列腺特异性抗原(freePSA，f-PSA)和f-PSA与前列腺特异性抗原-α1-抗糜蛋白酶复合物(PSA-ACT)的和(总PSA,t-PSA)。5.一种权利要求1所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱骅，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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