本发明专利技术公开了一种载脂蛋白C-III抗原多肽，抗载脂蛋白C-III多克隆抗体的制备与应用，属于生物技术领域。本发明专利技术所述抗载脂蛋白C-III多克隆抗体是以氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽为免疫原，与卵白蛋白OVA偶联后免疫新西兰兔制备抗血清，并用NHS激活的琼脂糖树脂与本发明专利技术的载脂蛋白C-III抗原多肽偶联制备抗体亲和纯化填料，进行抗体亲和纯化，对纯化后的抗体进行ELISA、Western blot鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别人血浆中的载脂蛋白C-III，可用于高甘油三酯血症患者血浆中载脂蛋白C-III的检测，为高甘油三酯血症诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。
【技术实现步骤摘要】
一种载脂蛋白C-Ⅲ抗原多肽及其多克隆抗体的制备与应用
本专利技术涉及一种载脂蛋白C-III抗原多肽，抗载脂蛋白C-III多克隆抗体的制备与应用，属于生物
技术介绍
载脂蛋白C-III是由79个氨基酸组成的小分子糖蛋白，是载脂蛋白C族中含量最丰富的一类，主要在肝脏中合成，仅小部分在小肠合成，载脂蛋白C-III主要分布于乳糜微粒、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白中。载脂蛋白C-III基因位于11号染色体长臂q23区，在载脂蛋白A-I和载脂蛋白A-IV之间，三者共同组成一个基因家族。载脂蛋白C-III的转录受胰岛素及过氧化物酶体增殖物激活受体等多种因素调控。载脂蛋白C-III具有抑制脂蛋白脂酶和肝脂酶活性的功能，可抑制肝脏摄取富含甘油三酯的脂蛋白及脂类分解，是血浆甘油三酯水平的主要调节因子。载脂蛋白C-III在血浆高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白之间相互转移，在血脂正常个体的血清中，载脂蛋白C-III大部分与高密度脂蛋白结合，而在高甘油三酯血症患者血清中，则大部分与极低密度脂蛋白结合。高甘油三酯血症是我国最常见的脂质代谢异常疾病，是引起冠心病的独立危险因素之一。随着我国肥胖人群的增加，高甘油三酯血症患者的数量也在逐年增加，其发病主要是由于富含甘油三酯的脂蛋白代谢障碍引起，患者血浆中载脂蛋白C-III含量显著高于正常人群，载脂蛋白C-III已成为高甘油三酯血症发生发展的有效标志物，制备载脂蛋白C-III多克隆抗体可用于开发高甘油三酯血症患病风险的诊断试剂，对探讨高甘油三酯血症的发病机制具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高甘油三酯血症标志物载脂蛋白C-III抗原多肽。本专利技术的另一目的是提供一种抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体。本专利技术的又一目的是提供上述抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体的应用。本专利技术通过以下技术方案实现上述目的：一种载脂蛋白C-III抗原多肽，氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。一种抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体，是以本专利技术的载脂蛋白C-III抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。上述抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体的制备方法，步骤如下：载脂蛋白C-III抗原多肽与载体蛋白卵白蛋白OVA偶联，作为免疫原与佐剂混合免疫新西兰兔，期间进行五次免疫，待ELISA检测血清抗体效价达1∶16000后，采集兔血清，进行亲和纯化，经过ELISA和Westernblot鉴定后，得到抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体。化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白偶联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽偶联的载体蛋白有多种，其中较为常用的血蓝蛋白(keyholelimpethemacyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)、卵白蛋白(ovalubumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovinethyroglobulin，THY)。由于OVA与本专利技术的载脂蛋白C-III抗原多肽偶联后免疫原性最强，因此本专利技术选用OVA作为偶联载体蛋白。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA常用于检测试验的阻断剂而使该方法生产的抗体在应用上存在一定的局限性。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益结果：本专利技术对载脂蛋白C-III氨基酸序列的理化性质、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的多肽序列进行人工合成；将合成的多肽与卵白蛋白OVA偶联后免疫新西兰兔；经过五次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达到理想值后收集免疫兔血清，并用NHS激活的琼脂糖树脂与本专利技术的载脂蛋白C-III抗原多肽偶联制备抗体亲和纯化填料，将填料装柱后进行抗体的亲和纯化，对纯化后的抗体进行ELISA、Westernblot鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别载脂蛋白C-III，具有特异性好、纯度高的特点，可用于检测人血浆中表达的载脂蛋白C-III，为高甘油三酯血症患者诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断。附图说明图1.经DNAstar软件分析载脂蛋白C-III免疫原性、亲疏水性及表面可及性，方框中显示的是选用合成的多肽序列片段。图2.抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体经抗原亲和纯化柱纯化后的SDS-PAGE电泳(12％)检测结果。泳道1：Marker；泳道2：上样；泳道3：流穿；泳道4：平衡；泳道5：洗脱上峰；泳道6：洗脱下峰。图3.抗载脂蛋白C-III多克隆抗体的Westernblot鉴定结果。泳道1：人血浆；泳道2：HepG2细胞。图4.本专利技术的实验流程。具体实施方式下面应结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于解释本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术的技术方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例1：载脂蛋白C-III抗原多肽设计1.根据载脂蛋白C-IIIGenBank登录号GI：4557323，获得人载脂蛋白C-III的蛋白序列(UniProt：P02656)，含有79个氨基酸。2.用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)在线分析载脂蛋白C-III的蛋白基本理化性质。分析结果见表1，载脂蛋白C-III分子量为8.7646KD，等电点为4.72，为酸性蛋白。表1载脂蛋白C-III基本理化性质分析结果3.用DNAstar软件分析载脂蛋白C-III免疫原性、亲疏水性及表面可及性，分析结果如图1，载脂蛋白C-III近C端有16个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。4.载脂蛋白C-III抗原多肽筛选将筛选出的16个氨基酸序列经Blastp分析，最终筛选多肽序列为：KFSEFWDLDPEVRPTS(60aa-75aa，SEQIDNO：1)。实施例2：载脂蛋白C-III抗原多肽合成及与载体蛋白偶联1.多肽由上海吉尔生化公司合成，纯度为93.85％。2.多肽与载体蛋白偶联将5mg多肽用50μlDMSO溶解，待溶解完全后，加入偶联缓冲液稀释至终体积为1ml，取出200μl用于ELISA检测，在剩余800μl多肽溶液中加入400μl浓度为10mg/ml的OVA溶液混匀后，再加入200μl浓度为10mg/ml的EDC，立即混匀含有EDC、OVA的多肽溶液，室温反应2h。3.偶联产物的超滤与分装将偶联产物用PBS稀释至4ml，用10KDMilipore超滤离心管对偶联产物进行超滤，每次超滤后将下管中滤液弃去，待上管中剩余液体约1ml时，继续用PBS稀释后进行超滤离心，循环超滤4次后，取上管中剩余液体1ml加入PBS稀释至3ml混匀，采用NanoDrop分光光度计测定偶联后蛋白浓度为1.272mg/ml，用0.22μm滤器过滤除菌后，每管分装偶联后蛋白500μl，-80℃保存。实施例3：抗载脂蛋白C-III多克隆抗体制备及纯化1.动物免疫免疫前于兔耳静脉取血，静置后离心取血清-80℃保存，作阴性对照血清。取分装后的偶联蛋白与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂等体积混匀后，用注射乳化器乳化，乳化结束后免疫新西兰兔(体重2～2.5kg)，具体免疫程序见表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种载脂蛋白C‑III抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种载脂蛋白C-III抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体，其特征在于以权利要求1所述载脂蛋白C-III抗原多肽为免疫原，免疫动物制备而成。3.根据权利要求2所述的抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体，其特征在于抗体效价为1∶16000。4.权利要求2所述抗载脂蛋白C-III的多克隆抗体制备方法，其特征在于步骤如下：权利要求1所述载脂蛋白C-III抗原多肽与卵白蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：李康，格桑罗布，
申请(专利权)人：西藏自治区人民医院，
类型：发明
国别省市：西藏,54
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