一种多肽抗原检测小鹅瘟抗体ELISA试剂盒制造技术

一种多肽抗原检测小鹅瘟抗体ELISA试剂盒，属于生物技术检测领域，利用人工合成3种GPV‑VP3特异性偶联多肽抗原作为包被液快速检测GPV抗体，有效提高多肽与目的抗体的结合效率，从而显著提高检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高。本发明专利技术的GPV抗体ELISA检测试剂盒具有操作简单、诊断速度快、成本低、在进行大规模检测中经济方便等优点,具有广泛的应用前景。

A polypeptide antigen of GPV antibody ELISA Kit

A polypeptide antigen of GPV antibody ELISA kit, which belongs to the field of biological detection technology, using 3 synthetic GPV VP3 specific binding polypeptide antigen as coated liquid for rapid detection of GPV antibodies, effectively improve the binding efficiency of polypeptide and antibody objective, thereby significantly improving the detection sensitivity and decrease nonspecific background readings, high specificity. The GPV antibody ELISA detection kit of the present invention has the advantages of simple operation, fast diagnosis, low cost, convenient and economical use in large-scale detection, and wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种多肽抗原检测小鹅瘟抗体ELISA试剂盒
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测鹅细小病毒的ELISA抗体检测试剂盒。
技术介绍
1.ELISA诊断技术的原理：酶联免疫吸附实验（ELISA）即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）；②酶标记的抗原或抗体（标记物）；③酶作用的底物（显色剂）。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。2.小鹅瘟：鹅细小病毒感染是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、急性、败血性传染病，主要侵害4周龄以内雏鹅和雏番鸭。传染性强，且死亡率高。雏鹅和雏番鸭以心肌炎、伪膜性肠炎、全身急性败血病变为特征。目前，此病每年都有不同程度地流行，仍为养鹅业和集约化养殖番鸭的国家中最主要的传染病之一，对水禽养殖业造成严重损失。1956年，我国学者方定一在江苏扬州首先发现了此病，并用鹅胚分离出世界上第一株禽细小病毒。目前虽然有不少的检测方法，例如琼脂扩散试验和琼脂扩散抑制试验，中和试验和动物保护试验，直接免疫荧光诊断法，免疫酶斑点法（Dot-ELISA）但是在一些基层单位缺乏相应的实验设备无法在第一时间进行诊断从而造成很大的损失。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种能快速、准确作出检测的多肽抗原检测GPV抗体的ELISA试剂盒。本专利技术包括GPV-VP3特异性多肽抗原包被的酶标板、阴性血清、阳性血清、抗体稀释液、用辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG酶标抗体、底物显色液、终止液：所述GPV-VP3特异性多肽抗原为以下三种BSA偶联多肽抗原中的至少任意一种：GPV-VP3-1BSA-CVTDEQEVAPTNGVGWKPYGKTVTNEQNTTTAPTSS；GPV-VP3-2LRKENSKRWNPEIQFTSNFSDRTSIC-BSA；GPV-VP3-3FKIFNVQVKEVTTQDQTKTIC-BSA。以上三种偶联多肽抗原为利用GPV-VP3特异性多肽，采用体外人工合成方法取得的多肽抗原。本专利技术利用人工合成多肽作为抗原，以获得灵敏度高、特异性高、操作简单、并快速检测GPV抗体的ELISA检测试剂盒。本专利技术利用三种多肽抗原（均进行偶联）研制了GPV抗体ELISA检测试剂盒，证明该试剂盒能够快速（约10min完成测定）、准确地检测GPV病毒抗体，具有良好的特异性和较高的灵敏性。本专利技术的有益效果：本专利技术采用GPV-VP3多肽抗原作为包被抗原，有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高，本专利技术的GPV抗体的ELISA试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前景。采用本专利技术的ELISA检测试剂盒检测GPV抗体，降低了检测成本，有利于推广使用。进一步的，本专利技术所述阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶50的比例将GPV-VP3多肽标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清。所述阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶50的比例将GPV-VP3多肽标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。以上标准阳性、阴性血清用于评价试剂盒检测结果的有效性。所述抗体稀释液为质量百分数为0.1%的BSA。以用于保持血清抗体的效价和稳定性，减少非特异性。所述用辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG酶标抗体是用HRP保护液按体积比为1∶2000～5000比例稀释后的抗鹅IgG酶标抗体。保护液保护酶标抗体的稳定性和效价。所述底物显色液为TMB。使阳性样本呈现不同深浅颜色，从而判定阳性的强弱。所述终止液为质量百分数为0.1%的SDS或2M的H2SO4，使酶促反应终止。所述GPV-VP3特异性多肽抗原包被的酶标板的制备方法是：取96孔酶标板，每孔100uLGPV-VP3特异性多肽抗原，4℃过夜包被，包被浓度为0.5ug/ml，用PBST洗涤液250uL/孔，洗涤2～4次拍干，用封闭液150ug/孔，37℃封闭1h，洗涤液PBST250ug/孔洗涤3次后拍干，放入真空袋，4℃抽真空保存。具体实施方式一、GPV-VP3特异性多肽抗原的制备方法：1、利用GPV-VP3特异性多肽，体外人工合成作为抗原快速检测GPV的抗体，制备过程：1）称取RINK树脂0.3g（取代度0.3mmol/g）于150mL的反应器中，用50mL的二氯甲烷（DCM）浸泡。2）2小时后，用3倍RINK树脂体积的氮-二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将RINK树脂抽干后待用。3）向反应器中加入5mL质量百分数为20%哌啶的DMF溶液（哌啶的DMF溶液由哌啶和DMF以体积比1∶4混合组成），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。然后用3倍RINK树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。4）取少量树脂用茚三酮（九井水合茚三酮）法检测检（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。5）称取碳端第一个氨基酸，根据氨基酸计算所需质量（0.3*0.3*AA的分子量）mg和1-羟基-苯骈三唑（HOBT）13.5mg于10mL的离心管中，加入1mL的DMF将其溶解，然后加入0.05mL的N，N-二异丙基碳二亚胺（DIC）振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。6）2小时后，用3mL醋酸酐混合液（醋酸酐混合液配方：醋酸酐、DIEA和DCM的体积比为1∶1∶2）封头半小时，然后用3倍RINK树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。7）向反应器中加入5mL质量百分数为20%哌啶的DMF溶液（哌啶的DMF溶液由哌啶和DMF以体积比1∶4混合组成），放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。然后用DMF洗涤四次，然后抽干。8）取少量树脂用茚三酮（九井水合茚三酮）法检测检（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功。9）称取后面设计中需要的第二个氨基酸（0.3*0.3*AA的分子量*3）mg和HOBT40.5mg于10mL的离心管中，加入1mL的DMF将其溶解，然后加入2.5mL的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。10）1小时后，取少量RINK树脂检测，用茚三酮法检测检（检A、检B各两滴，100℃反应1min），若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽抗原检测小鹅瘟抗体ELISA试剂盒，其特征在于：包括GPV‑VP3特异性多肽抗原包被的酶标板、阴性血清、阳性血清、抗体稀释液、用辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG酶标抗体、底物显色液、终止液：所述GPV‑VP3特异性多肽抗原为以下三种BSA偶联多肽抗原中的至少任意一种：GPV‑VP3‑1  BSA‑CVTDEQEVAPTNGVGWKPYGKTVTNEQNTTTAPTSS；GPV‑VP3‑2  LRKENSKRWNPEIQFTSNFSDRTSIC‑BSA；GPV‑VP3‑3  FKIFNVQVKEVTTQDQTKTIC‑BSA。

【技术特征摘要】
1.一种多肽抗原检测小鹅瘟抗体ELISA试剂盒，其特征在于：包括GPV-VP3特异性多肽抗原包被的酶标板、阴性血清、阳性血清、抗体稀释液、用辣根过氧化物酶标记的抗鹅IgG酶标抗体、底物显色液、终止液：所述GPV-VP3特异性多肽抗原为以下三种BSA偶联多肽抗原中的至少任意一种：GPV-VP3-1BSA-CVTDEQEVAPTNGVGWKPYGKTVTNEQNTTTAPTSS；GPV-VP3-2LRKENSKRWNPEIQFTSNFSDRTSIC-BSA；GPV-VP3-3FKIFNVQVKEVTTQDQTKTIC-BSA。2.根据权利要求1所述ELISA试剂盒，其特征在于：所述阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶50的比例将GPV-VP3多肽标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清。3.根据权利要求1所述ELISA试剂盒，其特征在于：所述阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1∶50的比例将GPV-VP3多肽标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：钱琨，顾晨曦，秦爱建，张杰，程晓薇，孔正茹，武宗仪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32