抗原表位肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗原表位肽，其氨基酸序列含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或含有对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列。该抗原表位肽可以用于产生抗原呈递细胞、主要组织相容性抗原复合物或细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，还能应用于制备治疗如NK/T细胞淋巴瘤的癌症的药物中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子免疫学领域，涉及抗原表位肽，具体涉及HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位肽及其应用。
技术介绍
NK/T细胞淋巴瘤是血液系统恶性肿瘤，在美国发病率不高但在亚洲特别是东亚，其发病率较欧美明显升高。NK/T细胞淋巴瘤原发部位多为鼻咽部，在接受联合放化疗及自体外周血造血干细胞移植后，部分患者可以达到治愈，但仍有不少患者最终会复发。目前认为这些患者复发的根源是因为体内存在微小残留病灶，因此需要一种有效的方法，能使接受放化疗或自体造血干细胞移植之后患者体内的微小残留病灶被有效清除。免疫治疗就是一种非常合适的选择。淋巴瘤细胞分泌的独特型抗原是一种肿瘤特异性抗原。有学者用这种独特型抗原给淋巴瘤患者接种以进行免疫治疗，但是这种治疗疗效让人失望，一部分原因被归咎于这种独特型抗原的免疫原性不够强。因此，迫切地需要发现一种大部分患者共有的新型的肿瘤抗原来改善免疫治疗对多发性NK/T细胞淋巴瘤的疗效。理想的肿瘤抗原应该在不同起源的肿瘤细胞表明表达，在正常组织中低表达或者不表达，而且在肿瘤细胞的生长及生存中不可或缺，这样肿瘤细胞才不可能通过不表达或者下调表达该抗原以逃避免疫攻击。潜伏性膜蛋白1(LMP1)和潜伏性膜蛋白2a(LMP2a)是多跨膜分子，缺乏有效的细胞外区域，都是组成性活性受体的独立配体。在EBV感染的肿瘤细胞中，LMP通过在细胞表面表达起到重要的信号传导作用，从而决定了细胞的生死。LMP通常表达于各种EBV相关肿瘤，包括鼻咽癌、伯基特瘤和NK/T细胞淋巴瘤等。近年来以LMP1为靶目标的免疫治疗证明，阻断LMP1在肿瘤细胞表面的表达，可以改善患者的预后。细胞毒性T细胞(CTL)可以通过细胞表面表达的MHCI类分子识别肽段，从而与靶细胞结合达到杀伤靶细胞的目的。MHCI类分子及抗原特异性肽段决定了CTL细胞杀伤靶细胞时的MHC限制性和抗原特异性。中国汉族人群MHCI类分子HLA-A位点0201表达率超过50％，故选择这一MHCI类分子广泛表达的位点研究CTL细胞抗原特异性。因此，本领域技术人员致力于开发一种HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别的表位肽。
技术实现思路
有鉴于现有技术中肿瘤特异性抗原的免疫原性不够强等问题，本专利技术提供了一种抗原表位肽及其应用。本专利技术的第一方面提供了一种抗原表位肽，其选自以下任一项：1)含有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，该肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。进一步地，上述抗原表位肽为SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的肽。本专利技术的第二方面提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码上述抗原表位肽的氨基酸序列。本专利技术的第三方面提供了一种抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞脉冲以上述抗原表位肽。本专利技术的第四方面提供了一种主要组织相容性抗原复合物，其包括HLA-A0201分子和上述抗原表位肽。本专利技术的第五方面提供了一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，该细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：1)如上所述的抗原表位肽；2)如上所述的抗原呈递细胞；或3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。本专利技术的第六方面提供了一种癌症疫苗，该癌症疫苗的活性成分包括：1)如上所述的抗原表位肽；2)如上所述的抗原呈递细胞；或3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。进一步地，上述癌症为NK/T细胞淋巴瘤。本专利技术还提供了上述抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。优选地，癌症为NK/T细胞淋巴瘤。免疫治疗一直是医学领域研究的热点，众多研究者寻找到许多NK/T细胞淋巴瘤的靶点，比如EBV-LMP1和LMP2a等，但这些靶点都有各自的局限性，这就需要我们不断寻找新的淋巴瘤治疗靶点，以最终达到个体化治疗的目的：对于每位患者检测其体内各种肿瘤抗原的表达情况，根据其强弱选择合适的靶点，以达到最佳的治疗效果，这种个体化的有差异的治疗也许是今后肿瘤免疫治疗的发展方向。本专利技术通过在线筛选、T2细胞亲和性和稳定性实验，筛选获得了两条目的抗原表位肽aa32和aa167。他们在健康供者及患者外周血中均存在，这为后续的研究供了必要条件。通过上述抗原表位肽，在专制抗原提呈细胞(如DC)的辅助下，激活CTL并使之扩增。激活后的CTL作用于LMP1蛋白来阻断免疫耐受及免疫忽视，提高其免疫原性，从而有效地杀伤NK/T细胞淋巴瘤细胞，但是其对正常造血细胞没有杀伤作用。据推测，在LMP1-CTL细胞下调了肿瘤细胞LMP1表达后，将会极大的恢复正常的活化T淋巴细胞的清除肿瘤作用。附图说明图1是本专利技术一个实施例的T2细胞亲和实验结果图。其中，阴性对照FLU-matrix为流感基质蛋白，阳性对照为HIVpol，aa32和aa167为两条预测的肽段。图2是本专利技术一个实施例的T2细胞结合稳定性实验结果图。图3是本专利技术一个实施例的LMP1-CTL产生结果图。图4是本专利技术一个实施例的LMP1-CTL增殖实验结果图。图5是本专利技术一个实施例的LMP1-CTL杀伤实验结果图。图6是本专利技术一个实施例的LMP1-CTL细胞功能实验结果图。具体实施方式以下将结合实施例对本专利技术作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本专利技术的保护范围。以下具体实施方式中使用的试剂，如无特殊说明，均可直接购买获得。流式细胞仪购自BECKMANCOULTER，型号为Navios。T2细胞购自ADCC。FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2购自ebioscience。FITC标记的CD8+单克隆抗体购自ebioscience。多肽的合成可以通过现有技术中的任何方法进行，如固相肽合成法等。氨基酸的替换：通过氨基酸替换可以获得类似或等同活性的突变体肽，该替换可以用具有与替换前的氨基酸的电荷、可溶性、亲水性/疏水性、极性类似的氨基酸进行。T2细胞亲和性和稳定性分析的原理：T2细胞缺乏内源性抗原肽提呈中必须的抗原加工相关转运蛋白，其本身表面只有少量空载的HLA-A0201分子表达且极不稳定。但当HLA-A0201分子和与之结合力强的肽段结合后，HLA-A0201的表达情况会增强并稳定。并且，HLA-A0201分子和肽段的结合力越强，T2细胞表面的HLA-A0201分子降解就越少，表现为HLA-A0201分子的表达量越高。因此，可以直接用T2细胞表面HLA-A0201分子表达的强弱来反应所预测表位肽与HLA-A0201的结合能力。同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。实施例1：HLA-A0201限制性LMP1蛋白CTL表位肽预测及合成(1)LMP1蛋白氨基酸序列的确定：通过在Genbank数据库中查找LMP1蛋白序列，利用Genbank登录号为：AAS99612.1的序列集，获得一种LMP1蛋白序列，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗原表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA‑A0201分子形成复合物而被HLA‑A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA‑A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。

【技术特征摘要】
1.一种抗原表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：1)含有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；2)含有SEQIDNo.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；3)通过对SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。2.如权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽为SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的肽。3.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1中所述的抗原表位肽的氨基酸序列。4.一种抗原呈递细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞脉冲以权利要求1或2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶荣，郝思国，张文皓，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属新华医院，
类型：发明
国别省市：上海;31