黄曲霉毒素B1的线性十二肽抗原模拟表位及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及黄曲霉素B1的抗原模拟表位，其氨基酸序列为DPRKHIH。本发明专利技术黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的AFB1标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了AFB1对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
黄曲霉毒素B1的线性十二肽抗原模拟表位及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及黄曲霉毒素B1抗原模拟表位及其应用。
技术介绍
黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中。AFB1对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，1993年被WHO的癌症研究机构划定为I类致癌物。因此，食品中AFB1的检测对于人类健康意义重大。目前，检测食品中AFB1的方法主要有高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱及免疫学检测等方法，免疫学检测方法以其灵敏度高、检测方便、成本低廉等优势在AFB1的检测中得到了广泛的应用。然而，在建立免疫学检测方法的过程中，必须使用AFB1标准品为原料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，AFB1不仅价格昂贵而且具有极强的致癌性，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁，从而在一定程度上制约了免疫学检测方法的应用和推广。有鉴于此，人们开始采用抗独特型抗体及抗原模拟表位技术来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。本专利技术通过用噬菌体展示肽库技术，从肽库中筛选出能与靶分子（抗AFB1单克隆抗体）特异性结合的多肽（抗原模拟表位），该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性，通过获得的AFB1抗原模拟表位，以代替价格昂贵且毒性强的AFB1标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测。
技术实现思路
本专利技术以抗AFB1单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，分别投入噬菌体随机展示环七、十二肽库，分别进行亲和淘选，获得了两种AFB1的抗原模拟表位（环七肽及十二肽各1种）。它们的氨基酸序列如下：AFB1抗原模拟表位1：从噬菌体随机环七肽库中筛选的AFB1抗原模拟表位（多肽），其氨基酸序列为：CDPRKHIHC。AFB1抗原模拟表位2：从噬菌体随机十二肽库中筛选的AFB1抗原模拟表位（多肽），其氨基酸序列为：VPYSPHYFERMI。本专利技术还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，优选为GATCCGCGTAAGCATATTCAT或GTTCCGTATTCGCCTCATTATTTTGAGCGTATGATT。上述抗原模拟表位（多肽）结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即C代表半胱氨酸残基，D代表天冬氨酸残基，P代表脯氨酸残基，R代表精氨酸残基，K代表赖氨酸残基，H代表组氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，V代表缬氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，S代表丝氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，E代表谷氨酸残基，M代表甲硫氨酸残基。模拟表位1的N末端和C末端的两个半胱氨酸残基形成分子内二硫键，为环状结构。本专利技术提及的AFB1抗原模拟表位（多肽）可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有AFB1抗原模拟表位（多肽）的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有AFB1抗原模拟表位（多肽）的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位1、模拟表位2的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位1或模拟表位2的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行AFB1抗原模拟表位的大量制备。本专利技术还涉及所述黄曲霉素B1抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。本专利技术黄曲霉素B1抗原模拟表位（CDPRKHIHC，VPYSPHYFERMI）在应用时，可以把合成的模拟表位用于免疫学检测分析，将通过噬菌体扩增获得的展示有AFB1抗原模拟表位（多肽）的噬菌体粒子直接用于分析检测，当然，也可以将AFB1抗原模拟表位从噬菌体上切下来代替AFB1标准品来进行免疫学检测分析。还涉及黄曲霉素B1抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的应用。还涉及黄曲霉素B1抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的应用。前述黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的AFB1标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性，效果非常好。本专利技术的有益效果是：本专利技术黄曲霉素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的AFB1标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB1的免疫学检测，该抗原模拟表位具有与天然AFB1分子相似的免疫反应特性，效果非常好。减少了AFB1对人体健康的危害，节约了成本，具有很高的应用价值。附图说明图1为以AFB1抗原模拟表位1建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围4.0-31.3ng/mL，IC50为11.7ng/mL。图2为以AFB1抗原模拟表位2建立的间接竞争ELISA标准曲线。检测范围4.6-50.1ng/mL，IC50为15.2ng/mL。具体实施方式实施例1.AFB1抗原模拟表位的亲和淘选及其鉴定1）AFB1抗原模拟表位的亲和淘选：具体方法为：用10mMPBS(pH7.4)稀释抗AFB1单克隆抗体，并以终浓度100μg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用TBST(50mMNaCl,pH7.5包含0.1%Tween-20(v/v))洗涤10次后，加入300μl封闭液（3%BSA-PBS）4℃孵育2小时。2小时后弃封闭液，用TBST洗涤5次，每孔加入100μl噬菌体肽库（噬菌体展示环七肽库或十二肽库，购自NEB公司，用TBS10倍稀释噬菌体原液，约1.0×1011pfu），22-26℃振荡反应1小时。弃去未结合的噬菌体，用TBST洗涤10次，结合上的噬菌体用0.2MGlycine-HCl(pH2.2)洗脱，并立即用15μl1MTris-HCl(pH9.1)中和。取10μl洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E.coliER2738菌株进行扩增。第三天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。在第二、第三轮的淘选过程中，包被的抗AFB1单克隆抗体浓度分别为75μg/mL和50μg/mL，所用的TBST浓度为0.25%和0.5%，其余步骤同上。2）阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑取20个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法（IndirectEnzymeLinkedimmunoasorbentassay,I-ELISA）进行阳性噬菌体克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10mMPBS(pH7.4)稀释抗AFB1单克隆抗体，10µg/mL包被96孔酶标板，4℃孵育过夜。第二天用PBST(10mMPBS,0.05%Tween-20(v/v))洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37℃孵育1小时；投入100µl噬菌体斑扩增液（1.0×1011本文档来自技高网...

【技术保护点】
黄曲霉素B1的线性十二肽抗原模拟表位，其特征在于其氨基酸序列为VPYSPHYFERMI。

【技术特征摘要】
1.黄曲霉素B1的线性十二肽抗原模拟表位，其特征在于其氨基酸序列为VPYSPHYFERMI。2.编码权利要求1所述线性十二肽抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸。3.如权利要求2所述的核苷酸，其序列为GTTCCGTATTCGCCTCATTATTTTGAGCGTATGATT。4.如权利要求1所述抗原模拟表位的制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有黄曲霉素B1的线性十二肽抗原模拟表位的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有黄曲霉素B1的线性十二肽抗原模拟表位的噬菌体粒子；所述化学合成指...

【专利技术属性】
技术研发人员：何庆华，许杨，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36