本发明专利技术提供一种用于纯化Apo A-I的方法，其包括提供包含Apo A-I和盐酸胍的溶液并通过具有从15nm至35nm的孔径范围的过滤器过滤该溶液从而减少Apo A-I的病毒污染的步骤。本发明专利技术提供一种Apo A-f制备物，其针对细小病毒具有至少12log的LRV(对数减少值)；和/或针对无包膜病毒具有至少9log的LRV；和/或针对脂质包膜病毒具有至少8.5log的LRV。本发明专利技术还提供包含Apo A-I的药物组合物和重构的高密度脂蛋白制剂以及用于治疗疾病、紊乱或病况的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于纯化载脂蛋白的方法，特别是用于从含有载脂蛋白A-I (ApoA-I)的溶液去除病毒病原体的方法，并涉及提供一种Apo A-Ι制备物。
技术介绍
载脂蛋白是可溶性脂蛋白复合体中的主要蛋白质组分，载脂蛋白A-I(ApoA-I)为 高密度脂蛋白（HDL)颗粒的主要蛋白质组分。 载脂蛋白的A、C和E家族由共同的祖先基因进化而来，它们在结构上是相似的。这 些蛋白质分子一般含有一系列22-氨基酸串联重复，其常常被脯氨酸残基分隔开。重复的 22-氨基酸节段形成两亲性的α-螺旋，其能够既与脂质结合又与水表面结合。在人Apo A-I (243个氨基酸;28.1kDa)的情况下，有八个22聚体和两个11聚体的两亲性螺旋(Lund-Katz& Phillips ,2010, Subcell Biochem. 51,183-227)。载脂蛋白的两亲性的α-螺旋在稳定脂蛋 白中起着关键性的作用。它们通过定向载脂蛋白来做到这一点，使得主要疏水性的螺旋面 能够与复合体中的疏水性脂质发生相互作用，而载脂蛋白的主要亲水性的相对面与周围含 水环境发生相互作用。但是，当这些蛋白质与脂质组分分开时，疏水性氨基酸残基暴露于含 水环境可使它们变得难以处理。特别是螺旋的疏水面具有自缔合的倾向，其导致聚集体 形成和在一些条件下发生沉淀。例如，据估计，当被存储于pH 7.4的50mM磷酸盐缓冲液中 时，lmg/mL含有Apo A-I Mi lano的溶液含有80 %的聚集形式的蛋白质（Suurkuusk&Hal Ι?η， 2002, Spectroscopy 16,199-206)〇 Apo A-I由肝脏和小肠合成并负责HDL在血液中的生理功能;通过被称为"反向胆 固醇运输"（RCT)的机制从外周组织去除胆固醇，将其运载回肝脏或其它脂蛋白。结果，HDL 颗粒以一系列尺寸存在于血浆中，并由于这些RCT脂质运输活性而不断重构。因此，HDL颗粒 的特征在于高密度(>l.〇63g/ml)并且尺寸范围为大约5至20nm(斯托克斯直径）。根据流行 病学和纵向研究，血清胆固醇水平的升高和冠状动脉心脏疾病(CHD)的发展之间的明显的 相关性已被多次证实。因此，HDL中的Apo A-Ι被认为具有抗炎功能并抑制CHD的发生和发 展。此外，Apo A-Ι已经显示出降低血液中低密度脂蛋白（LDL)水平和已知与脂多糖或内毒 素结合，从而在HDL的抗内毒素功能中具有主要作用。HDL和作为其主要蛋白质组成的Apo A-I的"保护性"的作用已在多项研究中被证实。Apo A-I的高血浆水平与CHD和冠状动脉病 变存在的降低的风险有关。因此，Apo A-Ι有希望应用于像重构的HDL的药物，其用于在急性 冠脉综合征、动脉粥样硬化治疗、抗炎治疗、抗毒素治疗、肝靶向药物等中的应用。 通常使用生物学原料制造重组或血浆来源的生物学药物，所述生物学原料被固有 地污染有诸如病毒的病原体。此外，一些制造方法由于其性质容易受到来自外部来源的病 原体污染。因此，需要生物学药物的制造商向他们的制造方法中引入足够的病毒清除步骤， 以确保他们的产品不含污染物。 用重组DNA在细胞培养物、转基因动物或转基因植物中生产生物技术产品（通常为 蛋白质或DNA)。生产中使用的常见细胞包括中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、大肠杆菌细菌和酵 母。通常以分批模式实施基于细胞的生产系统，然而也在使用少量灌注系统。主要以基于 CHO的8，000-25，000L规模的发酵器在1，000-100，000L的规模进行最终商业规模的发酵。 现在，大量收集人血浆(例如，据已估计，在2010年全世界收集了 3千万升的血浆） 并将其加工成各级分;这些级分中的一些级分含有载脂蛋白，Apo A-Ι。这样的血浆级分的 实例包括科恩上清I，科恩级分Π +ΙΙΙ和科恩级分IV(例如科恩级分IV-1)或其变化(例如为 Kistler/Nitschmann级分IV)。因为血液和血浆潜在地含有输血传播的病原体，当血液来源 的或血浆来源的组分被用作药物或用作治疗递送的载体时，这样的病原体、特别是病毒必 须被去除或灭活。但是，即使这些组分被高度纯化，病毒通常不容易被去除并且可能仍然存 在于血浆来源的组分中。特别受到关注的尤其是小的无包膜病毒，诸如尺寸为大约27-32nm 的小核糖核酸病毒科(例如甲型肝炎病毒)和尺寸为大约18_26nm的细小病毒。这是由于它 们的小尺寸和它们的高物理化学稳定性。因此，存在开发使得血浆来源的蛋白质药物的病 毒被有效去除或灭活的方法的持续需要。 常见的病毒灭活技术包括物理方法诸如经典的巴氏灭菌操作(60°c加热10小时）， 短波长紫外光照射或γ射线照射和化学方法诸如溶剂去污剂或低pH温育。病毒去除技术包 括尺寸排阻方法诸如病毒过滤，其也常常被称为纳米过滤。这些病毒过滤方法已被证明是 用于从蛋白质溶液中去除病毒的有效方法。 病毒过滤具有用于从蛋白质溶液中去除病毒的温和方法的益处，并且通常允许高 的蛋白质回收水平并完全保留蛋白质的生物学活性。最佳的病毒过滤器必须使得容量、处 理量(throughput)和选择性最大化。病毒过滤器的容量是恒压过滤期间在通量下降到不可 接受的低值之前每m 2过滤器的表面积能够处理的滤液的总体积。处理量是指进料可被过滤 的速度(最大可持续透过通量）。选择性是指产生高的产品回收和高的病毒颗粒保留的能 力。这些过滤器必须能够以可接受的滤液通量处理整个批量的进料，拒绝病毒颗粒，并使蛋 白质通过最大化。病毒过滤期间的结垢通常受蛋白质聚集体、DNA、部分变性的产物或其他 碎片控制。过滤器制造商通常给市售过滤器指定像标称或平均的孔径等级的术语，其通常表 示满足某种颗粒或微生物保留标准，而不是表示实际孔的几何尺寸。对于病毒清除，通过过滤膜进行过滤，所述过滤膜具有小于待去除的病毒的有效 直径的标称孔径。只有少量异常大的孔(300kDa或更大的标称截留分子量，NMWC0)的存在将 允许过量病毒泄漏。因此，必须这样制造病毒过滤器以便消除所有宏观缺陷。这通常是通过 使用复合膜实现的，其提供所需的病毒保留和机械稳定性的组合。如以下文献:Manabe.S， Removal of virus through novel membrane filtration method.,Dev. Biol. Stand., (1996)88:81_90;Brandwein H等人，Membrane filtration for virus removal., Dev Biol(Basel) ·，（2000)102:157-63;Aranha-Creado等人，Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter.，Biologicals.(1998)June; 26 (2):167-72 ;Moce-Ll ivina等人， Comparison of polyvinylidene fluoride and本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于纯化载脂蛋白A‑I(Apo A‑I)的方法，其包括通过具有适合于减少Apo A‑I的病毒污染的孔径的过滤器过滤包含Apo A‑I和盐酸胍(GuHCl)的溶液。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：G·瓦仁，Y·卢西亚，C·凯姆佩，M·斯图克基，
申请(专利权)人：杰特有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU
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