本发明专利技术涉及从含Apo A‑I的蛋白质级分(A)获得Apo A‑I的方法，包括悬浮含Apo A‑I的蛋白质级分(A)在缓冲溶液(B)中，从悬浮液中除去杂质，同时保持增溶的Apo A‑I蛋白质，随后从悬浮液中沉淀Apo A‑I和收集Apo A‑I沉淀物。通过这样的方法获得的Apo A‑I，由这种Apo A‑I获得的重构的HDL，和包括这样的Apo A‑I和/或重构的HDL等的药物组合物也被提供。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术设及从含有ApoA-I的蛋白质级分回收载脂蛋白A-I(ApoA-I)的方法。
技术介绍
人载脂蛋白A-I是化DL)的主要蛋白质组分，其是在血液中的重要脂蛋白。它是 由肝脏和小肠合成并负责的皿L在血中的生理功能；从外周组织去除胆固醇，将其运载回 肝脏或其它脂蛋白，运通过被称为"反向胆固醇运输"（RCT)的机制。 根据流行病学和纵向研究，血清胆固醇水平的升高和冠状动脉屯、脏疾病的发展之 间的明显的相关性已被多次证实。 因此，高密度脂蛋白化DL)中的ApoA-I被认为具有抗炎功能和抑制冠屯、病的发 生和发展。此外，ApoA-I已经显示出降低血液中低密度脂蛋白（LDL)水平和已知结合到 内毒素，从而在高密度脂蛋白的抗内毒素作用中具有主要作用。 阳0化]高密度脂蛋白和ApoA-I的"保护性"的作用作为其主要性质已在多项研究中被 证实，使得ApoA-I成为有希望的候选物（特别是作为重构的皿L的一部分），用于在动脉 粥样硬化治疗，急性冠脉综合征的治疗（ACS)，抗炎治疗，抗毒素治疗，肝祀向药物等中的应 用。 人血浆在现今W大量被收集和被处理成各级分，其中一些含有载脂蛋白A-I。 所述级分可能由乙醇分级分离根据在美国最初开发和称为科恩或科恩-化cley方法 的方法来制备圧.J.Cohn等人，J.Am.Chem.Soc. 68, 459-475, 1946 ;J.L.Oncl巧等 人，J.Am.化em.Soc. 71，541-550, 1949]。含有载脂蛋白的血浆组分也可通过运种方法 的一个变体，Kistler-化tschmann方法来制备出.化tschmann等人，Helv.Qiim.Acta 37, 866-873, 1954 ;P.KistlerandΗ.化tschmann,VoxSang7, 414-424, 1962]。运两种方 法都基于示差沉淀醇。 各种方法已在文献中被描述从乙醇沉淀级分回收载脂蛋白A-I : 例如，US5089602设及通过再悬浮级分在抑范围为3至5或6至9的含水缓冲溶 液，从人血浆或血清级分制备载脂蛋白。通过加入短链脂肪醇析出不良污染物。使用了含有 高乙醇浓度的化8-96%乙醇）缓冲液进行沉淀污染物。通过升高的溫度，微碱性抑值，或 者通过加入离液剂或表面活性物质（其随后通过凝胶过滤除去）抑制脂蛋白的潜在聚合。 阴离子交换层析步骤被包括W结合污染物，而载脂蛋白通过。 Kim等人，Manufacturing and Shelf Stability of Reconstituted High-density Lipoprotein for Infusion Ther曰py, Biotechnology and Bioprocess 化gineering 16,785-792(2011)公开了使用含有在6M的浓度的脈的提取缓冲液。 上述两种方法的组合在W0 98/07751被说明为用于从人血浆中回收载脂蛋白 A(ApoA-I)或载脂蛋白E(ApoE)。所述文献公开了一种方法，其包括通过使用含有8M脈 素的提取缓冲液中的至少一个预纯化步骤，使用阴离子交换层析的进一步纯化步骤。在 W0 98/07751中，由使用含有20%乙醇的提取缓冲液的实验导致ApoA-I的1%的回收率。 W02009/025754教导从α-1抗膜蛋白酶分离ApoA-I的方法，包括使用较低的乙醇浓度（8 至 14 % )，W沉淀ApoA-I。 其他方法，如超高速离屯、机和高效液相色谱（册LC)也可用于回收ApoA-I。然而， ApoA-I的制备是非常耗时和仅少量的ApoA-I可W通过运些方法来制备。运些方法因此 不适合于ApoA-I的工业生产。 因此，仍然需要一种用于从含ApoA-I的蛋白质级分提取和回收ApoA-I的方法， 其是适合于大规模生产，并且其允许W高产率获得ApoA-I。
技术实现思路
本文提供的是从含ApoA-I的蛋白质级分（A)获得ApoA-I的方法，包括：a)悬 浮含ApoA-I的蛋白质级分于缓冲溶液，其含有15至30%的直链的或支链。至C4醇（w/ W)W形成悬浮液，其中所述悬浮的含ApoA-I的蛋白质级分（A)具有6. 4至10.0的范围的 抑，化）从所述悬浮液中除去杂质，同时保持ApoA-I蛋白溶解（增溶），（C)从悬浮液沉淀 ApoA-I，W及（d)收集所述的ApoA-I沉淀物。 在一些实施方案中，缓冲溶液包括20% (w/w)的直链或支链。至C4醇。在一些 实施方案中，悬浮的含ApoA-I的蛋白质级分（A)具有从8. 1到8. 5的范围的抑。在一些 实施方案中，悬浮的含ApoA-I的蛋白质级分（A)具有7. 0至7. 6的范围的抑。在一些实 施例中，缓冲溶液包含5mM至35mM的NaHC〇3。在一些实施方案中，直链或支链。至C4醇是 乙醇。 阳015] 在一些实施方案中，ApoA-I蛋白质级分与缓冲溶液的体积比在步骤（a)中是从 1 :1 至。1 :5。 在一些实施方案中，在步骤（a)形成的所述悬浮液具有小于5mS/cm的电导率。 阳017] 在一些实施方案中，在步骤化）中，通过加入直链或支链的。至C4醇至45至65% (w/w)的醇浓度导致沉淀，除去杂质。在一些实施方案中，在步骤化）加入的直链或支链的 。至〇4醇具有约-5°C至15°C的溫度。在一些实施方案中，在步骤化）沉淀的杂质从所述 悬浮液中通过过滤，离屯、，倾析，超滤和/或沉降而除去。 在一些实施方案中，在步骤（C)中，悬浮液的抑调节为4.6至5.6的范围内。在 一些实施方案中，在步骤（C)中，该悬浮液具有-2~20°C的溫度W用于ApoA-I的沉淀。 在任何实施例中，该方法可W进一步包括步骤（e)，其中，例如通过加入醇例如在 为约40%至约96% (w/w)乙醇范围内的浓度的乙醇，使得所收集的ApoA-I的沉淀物脱脂 (去脂）。在具体实施方案中通过加入乙醇至浓度为约40%，或者约50%使得所收集的Apo A-I的沉淀物脱脂。乙醇可W是任何药物级乙醇。在本专利技术的具体实施方案中乙醇是95% 的药物级乙醇（含有5%甲醇的3A)。 根据一些实施例，该方法W至少0. 50克/升血浆的产率生产纯化ApoA-I。 在本专利技术的另一个方面，提供了纯化ApoA-I，其包括：（a)小于0. 3毫克（mg)的 IgA每克的ApoA-I。 还提供了通过如本文所述任何方法获得的ApoA-I，包括运样的ApoA-I和药学上 可接受的载体或稀释剂的药物组合物和/或生产运种组合物的方法。 还提供了从通过如本文所述任何方法获得的ApoA-I制备的重构的皿以包括运 种重构的皿L和药学上可接受的载体或稀释剂的组合物和/或生产重构的皿L和/或包含 其的药物组合物的方法。 附图的简要说明 阳0巧]图.1 :缓冲液体积，缓冲液浓度，乙醇浓度，溫度，抑和混合时间对ApoA-I产率 的影响。图1示出了当使用含有较低浓度乙醇的缓冲液（缓冲溶液）度）时从血浆获得的 ApoA-I的产率达到最大。 图.2 :乙醇浓度，抑对ApoA-I产率的影响。图2表明，当使用含有在15和30% 的范围内的浓度的乙醇的缓冲液（缓冲溶液）度）时从血浆获得的ApoA-I的产率被最本文档来自技高网...
【技术保护点】
从含Apo A‑I的蛋白质级分(A)获得Apo A‑I的方法，包括：(a)悬浮含Apo A‑I的蛋白质级分(A)在含有15～３0％的直链或支链C1至C4醇(w/w)的缓冲溶液(B)中，其中所述悬浮的含Apo A‑I的蛋白质级分(A)具有6.4至10.0的范围内的pH，(b)从所述悬浮液中除去杂质，同时保持溶解的(增溶的)Apo A‑I蛋白，(c)从所述悬浮液中沉淀Apo A‑I，和(d)收集Apo A‑I沉淀物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：Y·弗茨卡，G·L·沃伦，
申请(专利权)人：杰特有限公司，
类型：发明
国别省市：澳大利亚;AU
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