一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，包括设在固定板上依次相连的样品垫、纳米材料垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，在硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体，在纳米材料垫上设有金包银纳米金壳复合物。本发明专利技术还公开了一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条的制备方法，本发明专利技术应用于检测人血和/或尿NGAL，早期诊断急、慢性肾损伤特异性高，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好分辨光信号，其免疫层析的速度加快，有利于试纸的快速检测，增强检测信号达1000倍。结果易观察，灵敏度达到10pg/mL，15分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术应用领域，具体地说是一种纳米材料检测试纸条及其制备方法。
技术介绍
NGALCNeutrophiL GeLatinase Associated LipocaLin)的分子量 22KD、也有报告25KD，主要存在于中性类细胞内，其他组织中存量很少。各种原因(创伤、中毒、感染、疾病)导致急性和慢性肾损伤时，肾脏组织NGAL量明显升高释放入血液。检测血和/或尿NGAL是判断和评估急性和慢性肾损伤的生物标志物，是肾实质结构损伤的指标。类似诊断急性心肌梗死损伤的金标准心肌肌钙蛋白I、T。目前临床诊断急性和慢性肾损伤(功能不全)主要是检测血肌酐(creatine)，尿素氮、尿微量蛋白，均为肾损伤的间接功能指标。急性肾损伤后，2-3天血肌酐方出现。NGAL在急性肾损伤2-3小时后在血和尿中就明显升高，检测NGAL提前和极大提高了诊断肾实质损伤的能力的时间，对合理诊治，降低死亡率提供了客观依据。美国医院住院病人中急性肾损伤肾功能损伤患者约占总数5_7%，在医院重症病房(ICM)病人中比例高达25%，死亡率高达50-80%。急性和慢性肾损伤涉及心脏手术、化疗和放疗、重症高血压、糖尿病、败血症、心力衰竭、以及各种类型心肾综合征。该类病在美国麻省23家医院急性肾损伤(AKI)年花费保守估计80亿美元。因此，应用本申请专利检测NGAL将发挥巨大的社会和经济效益。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，专门用于检测人尿液或血液中的NGAL，其具有操作简便、灵敏度高，检测0.01-0. Ing/mL较传统方法敏感性提高1000倍、结果稳定等优点。本专利技术解决的另一个技术问题是提供一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条的制备方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，包括设在固定板上依次相连的样品垫、纳米材料垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，在硝酸纤维素膜上设有检测线抗体和质控线抗体，在纳米材料垫上设有金包银纳米金壳复合物。优选地，其中金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将40-60nm、10_20nm纳米金包银壳标记物相联的复合物。优选地，其中特定单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2或SEQID NO:3 或 SEQ ID NO:4。优选地，其中金包银纳米金壳复合物中包含有显色抗体鼠抗人NGAL抗体B0T05，检测线抗体中包含有抗人NGAL单克隆抗体也称为捕捉抗体B0T06，所述质控线抗体为羊抗鼠 IgG0优选地，其中特定单链DNA长度为30-80bp，特定单链DNA 3’端标有生物素，特定单链DNA5 ’端连有巯基(-SH)。优选地，其中显色抗体与捕捉抗体为两株可互相配对形成夹心的抗人NGAL单克隆抗体。优选地，所述纳米材料垫为聚酯纤维膜制成的垫。优选地，其中样品垫为玻璃纤维膜制成的垫。 本专利技术的另一个技术方案为高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条的制备方法，包括以下步骤 (1)纳米金壳溶液的制备； (2)金壳标记制备和确认金包银壳纳米材料(40-60nm和10_20nm)尺寸和纯度确定； (3)金包银纳米金壳复合物的制备，即将信号抗体B0T05与10-20nm和40_60nm金包银壳标记物相联的复合物； 用0. IM K2C03调节PH8. 5-9. 0 ;将NGAL信号单抗B0T05与纳米壳比列调整为4:100(U g/ml) +将单链DNA3’端标有生物素的30_80bpSSDNA与纳米壳信号抗体价链联接反应6-8小时，25 0C，其终浓度为0. 5-2. OuM； 将SSDNA与纳米壳信号抗体复合物加进PEG8000终浓度为0. 2-1. 0%，2MNaCl/20mM phosphate 调节 SSDNA 纳米壳复合体 PH 至 7. 4 ; 将上述PH7. 4复合体与链亲和素、辣根过氧化酶(终浓度0. 4 PM)在25 °C条件下，孵育4小时，离心，沉淀清洗3次，保存4°C备用； (4)金壳纳米材料垫制备； (5)硝酸纤维素膜预处理和备用； (6)制备和组装金壳纳米材料垫； (7)检测线制备； (8)质控线制备； (9)试纸条装配； (10)检测。其中，步骤(3)中单链DNA长度为43bp，所述将SSDNA与纳米壳信号抗体复合物加进PEG8000终浓度为0. 5。有益效果本专利技术使用多种尺寸中空的金纳米壳代替目前胶体金试纸条常用的球形纳米颗粒。应用于人血和/或尿NGAL检测，特异性高，在基于白色背景下能比球形金纳米颗粒产生更好的分辨光信号。而且由于中空金壳的重量轻于同样大小的实心纳米金颗粒，其免疫层析的速度加快，有利于试纸的快速检测。应用特定条件下纳米粒子与DNA和蛋白质共价键结合机制，生物素标记的单链DNA连接二种尺寸的纳米抗体，增强检测信号达1000倍。结果易观察，灵敏度达到10pg/mL，15分钟内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性。操作简便，无需特殊仪器设备，可应用于各种原因导致的急性肾损伤的早期诊断，慢性肾功能不全透析及治疗效果评判。尤其适宜在广大基层医院推广和应用。附图说明图I为本专利技术最佳实施例的整体结构示意 I、样品垫 2、纳米材料垫功能化IOnm金壳、信号抗体B0T05、功能化50nm信号抗体B0T05 3、硝酸纤维素膜4、吸收垫 5、检测线抗体 6、质控线抗体具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本专利技术，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。本实验用到的材料 检测线抗体为抗人NGAL单克隆抗体B0T06为捕捉抗体，质控线抗体为羊抗鼠IgG，金壳标记抗体包含有显色抗体为鼠抗人NGAL抗体B0T05，购买于Genscript The Biology CRO南京公司。金包银纳米金壳复合物所用到的特定单链DNA是由本公司设计合成制得。其他材料均自市场上购买。实施例I 如图I所示，一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，包括设在固定板上依次相连的样品垫I、纳米材料垫2、硝酸纤维素膜3和吸收垫4，在硝酸纤维素膜3上设有检测线抗体5和质控线抗体6，在纳米材料垫2上设有金包银纳米金壳复合物。其中，金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将40-60nm和10_20nm纳米金包银壳标记物相联的复合物。其中，特定单链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: I或SEQ IDNO:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4。其中，金包银纳米金壳复合物是通过特定单链DNA将50nm和IOnm纳米金包银壳标记物相联的复合物。其中金包银纳米金壳复合物中包含有显色抗体鼠抗人NGAL抗体BT05，检测线抗体中包含有抗人NGAL单克隆抗体也称为捕捉抗体BT06，所述质控线抗体为羊抗鼠IgG。所述特定单链DNA长度为30_80bp，特定单链DNA3’端标有生物素，特定单链DNA5’端连有巯基(-S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高敏感性中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL的纳米材料检测试纸条，其特征在于：包括设在固定板上依次相连的样品垫（1），纳米材料垫（2），硝酸纤维素膜（3）和吸收垫（4），在硝酸纤维素膜（3）上设有检测线抗体（5）和质控线抗体（6），在纳米材料垫（2）上设有金包银纳米金壳复合物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张寄南，鲁翔，杨俊伟，郭志睿，王迪斌，
申请(专利权)人：南京医科大学第二附属医院，南京博天科智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：