血清脂类、脂蛋白及载脂蛋白高效浓缩提取方法技术

本发明专利技术提供了一种从血清中浓缩提取脂类、脂蛋白和载脂蛋白的新方法。该方法充分利用阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的搭配使用，采用合适的沉淀剂浓度，并控制沉淀时间，使得到的溶解液中各种成分的比例接近原血清中各种成分的比例，且减少了操作步骤。所得的血清脂类、脂蛋白和载脂蛋白仍保持较好的水溶性和生物活性。该法简单、高效，适合大规模制备，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体的，涉及到一种血清中脂类、脂蛋白和载脂蛋白的 提取浓缩方法。
技术介绍
近年来，随着生活水平的提高和生活方式的改变，心脑血管疾病已成为威胁人类 生命健康的头号杀手。目前我国已有超过1. 6亿人患有高血脂,有上千万的心脑血管疾病 病人，平均每十几秒就有一人死于心脑血管病。这使得心脑血管疾病超过癌症、乙肝、艾滋 病等，成为我国死亡率最高的一类疾病。 这类疾病涉及到血清中的脂类以及相关的蛋白浓度的异常，这些物质主要有胆 固醇（TC)、甘油三酯（TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)、载 脂蛋白Al (ApoAl)、载脂蛋白All (Ap0AII)、载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白E(ApoE)、载脂蛋白 D(ApoD)、载脂蛋白H(ApoH)以及脂蛋白（a) (Lp(a))等，这些物质在血液中的运输和代谢情 况与人的健康有着密切联系。部分物质的含量或结构发生变化预示着人体健康状况的改 变。所以对于这些脂类、脂蛋白和载脂蛋白的研究有重要意义，因而成为学界的热点。而其 中具有重要诊断学意义的有TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoAl、ApoB和Lp (a)。本专利技术即以以上 七种物质作为目标进行研究。 浓缩提取得到符合条件的血清脂质、脂蛋白和载脂蛋白是进行后续研究的关键， 而国内外关于血清脂蛋白和载脂蛋白的提取浓缩的方法有很多。如超高速离心法，虽然方 法操作也很简便，只需用盐（如NaCl、KC1、NaBr等）来调节血清的密度，然后用离心机分 离，调节合适的转速就可使相关脂类、脂蛋白和/或载脂蛋白有较好的分离，但是所使用的 超高速离心机价格昂贵，一般实验室很难装备；其他提取方法还有毛细管电泳法，此法对少 量样品可以得到较好的分离效果，但不适用于大规模血清脂蛋白的浓缩提取，且电泳后蛋 白质大多已变性，难以进行后续研究；此外还有层析柱色谱法，这类方法都需要用到色谱填 料，价格昂贵，所需成本较高，只适合于制备高纯度的蛋白。另外也有报道用有机溶剂提取 脂蛋白，但是使用有机溶剂后脂蛋白的水溶性会降低，影响后续应用。 因此，本专利技术迫切需要开发一种高效、成本低廉、适合大规模浓缩提取的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效、简便，适合大规模浓缩提取脂蛋白和载脂蛋白的 方法。 本专利技术第一方面提供了一种从血清中提取脂蛋白及载脂蛋白的方法，所述方法包 括以下步骤： (a)向血清原料中加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第一混合物， 并对所述第一混合物静置后离心，分别得到上清液甲及沉淀乙； (b)向上清液甲加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第二混合物，并 对所述第二混合物静置后离心，分别得到上清液丙及沉淀丁； (C)将沉淀乙和沉淀丁合并，加入沉淀溶解液溶解，形成合并溶液； (d)对所述合并溶液进行离心，获得上清液，即为含有目标脂蛋白和载脂蛋白的溶 液。 在另一优选例中，所述方法还包括： (e)对步骤（d)中的所述上清液进行检测，其中，检测目标脂类、脂蛋白和载脂蛋 白选自下组： 胆固醇（TC)、甘油三酯（TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C)、载脂蛋白Al (ApoAl)、载脂蛋白B(ApoB)、脂蛋白（a) (Lp (a))或其组合。 在另一优选例中，所述的检测项目包括定性或定量检测。 在另一优选例中，步骤（a)中的阴离子沉淀剂选自下组：硫酸右旋糖苷（Dextran sulface, DS)和肝素盐；和/或 二价金属阳离子沉淀剂包括阳离子选自下组的盐类：Ca2+、Mg2+、Mn 2+或其组合。 在另一优选例中，所述的盐类为可溶性盐类。 在另一优选例中，阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的组合为DS和CaCl2。 在另一优选例中，步骤（a)中，在所述第一混合物中，阴离子沉淀剂的最终浓度范 围为0.02%-0.1%，优选地，为 0.04-0.06%^/^);和/或 在所述第一混合物中，二价金属阳离子沉淀剂的最终浓度范围为0. 0 2mo 1 / L-0. 2mol/L，优选地，为 0? 08mol/L-0. 15mol/L。 在另一优选例中，步骤（a)中静置时间为10-20小时，较佳地为12-18小时，和/ 或静置温度为〇_4°C ;和/或 步骤（b)中静置时间为2-4小时，和/或静置温度为0-4°C。 在另一优选例中，步骤（a)和步骤（b)的离心条件包括：转速为3000-5000r/min, 离心时间为20-60min ;和/或 步骤（d)中的离心条件包括：转速为10000-15000r/min，离心时间为20-60min。 在另一优选例中，在步骤（C)中，先用沉淀溶解液将沉淀乙溶解，获得第一溶液， 然后放置备用； 并在获得沉淀丁后，将所述沉淀丁与所述第一溶液合并，充分溶解，获得所述合并 溶液。 在另一优选例中，所述的沉淀溶解液选自下组：Triton X-114、NaCl、NP-40、SDS、 DOC 和 Triton X-100, K2C2O4 或其组合物。 在另一优选例中，血清与沉淀溶解液的体积比范围为100:1-20:1，较佳的为 80:1-20:1，更佳的为 60:1-20:1。 在另一优选例中，所述的沉淀溶解液含有选自下组的一种或多种组分： K2C2O4 ：0. 2-lmol/L ； SDS ：0. 5-2% (w/w)； DOC :0.2-1% (w/w)； NP-40 ：0. 5-1. 5% (w/w)； Triton X-114 ：1~3% (v/v)； Triton X-100 :1-3% (v/v)； NaCl :100_200mmol/L。 在另一优选例中，所述沉淀溶解液中含有0. 25M的K2C2CO4或其与其他所述组分的 组合。 在另一优选例中，步骤（b)中，所述第二混合物中，阴离子沉淀剂的最终浓度范围 为 0? 5-1 % (w/w)，优选地，为 0? 6-0. 8% (w/w);和 / 或 步骤（b)中，所述第二混合物中，二价阳离子沉淀剂的最终浓度范围为0. Imol/ L-0. 5mol/L，优选地，为 0? 1-0. 3mol/L。 在另一优选例中，所述阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的组合为DS和 CaCl2。 在另一优选例中，所述的脂类、脂蛋白和载脂蛋白选自下组：胆固醇（TC)、甘 油三酯（TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)、载脂蛋白 八1(六口〇六1)、载脂蛋白8(六口〇8)、脂蛋白（&)(14)(&))或其组合。 本专利技术的第二方面提供了一种血清中脂类、脂蛋白及载脂蛋白的提取物，所述的 提取物是用本专利技术第一方面的方法制备的。 在另一优选例中，所述的提取物含有选自下组的7种脂类、脂蛋白和载脂蛋白：胆 固醇（TC)、甘油三酯（TG)、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从血清中提取脂类、脂蛋白及载脂蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(a)向血清原料中加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第一混合物，并对所述第一混合物静置后离心，分别得到上清液甲及沉淀乙；(b)向上清液甲加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第二混合物，并对所述第二混合物静置后离心，分别得到上清液丙及沉淀丁；(c)将沉淀乙和沉淀丁合并，溶解，形成合并溶液；(d)对所述合并溶液进行离心，获得上清液，即为含有目标脂蛋白和载脂蛋白的溶液。

【技术特征摘要】
1. 一种从血清中提取脂类、脂蛋白及载脂蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步 骤： (a) 向血清原料中加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第一混合物，并对 所述第一混合物静置后离心，分别得到上清液甲及沉淀乙； (b) 向上清液甲加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第二混合物，并对所 述第二混合物静置后离心，分别得到上清液丙及沉淀丁； (c) 将沉淀乙和沉淀丁合并，溶解，形成合并溶液； (d) 对所述合并溶液进行离心，获得上清液，即为含有目标脂蛋白和载脂蛋白的溶液。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a)中的阴离子沉淀剂选自下组：硫酸 右旋糖苷和肝素盐；和/或 二价金属阳离子沉淀剂包括阳离子选自下组的盐类：Ca2+、Mg2+、Mn2+或其组合。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a)中，在所述第一混合物中，阴离子沉 淀剂的最终浓度范围为〇. 02-0. 1% (质量）；和/或 在所述第一混合物中，二价金属阳离子沉淀剂的最终浓度范围为〇. 02mol/L-0. 2mol/ L〇4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a)中静置时间为10-20小时；和/或 静置温度为〇_4°C ;和/或 步骤（b)中静置时间为2-4小时，和/或静置温度为0-4°C。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（a)和步骤（b)的离心条件包括：转速 为 3000-5000r/min，离心时间为 20-60min...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子樵，陈亮德，
申请(专利权)人：浙江蓝怡医药有限公司，上海蓝怡科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33