本发明专利技术提供了一种能够与结核病阳性血清特异结合的多肽，所述的多肽为A和B中的一种或两种的组合，其中A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还提供了一种结核病血清学诊断试剂盒，所述试剂盒中含有上述与结核病阳性血清特异结合的多肽。另外，本发明专利技术还提供了一种基于噬菌体展示多肽的结核病诊断试剂盒，该试剂盒中包含有核心噬菌体P1和核心噬菌体P4，其中核心噬菌体P1为展示多肽A的噬菌体，核心噬菌体P4为展示多肽B的噬菌体。本发明专利技术所提供的多肽和其相应的核心噬菌体的灵敏度和特异度高，具有良好的临床诊断价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供了能够与结核病阳性血清特异结合的多肽，以及基于多肽的诊断试剂盒，更涉及了一种基于噬菌体展示多肽的结核病诊断试剂盒，属于生物制剂领域。
技术介绍
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)是由德国细菌学家柯赫(Robert Koch)于1882发现并证实为引起结核病(Tuberculosis,TB)的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了Mtb，在某些发展中国家中，成人Mtb携带率高达80％，其中约5％～10％携带者可发展为活动性结核病。目前，结核病诊断方法主要有以下几种：(1)细菌学诊断：包括痰涂片镜检法和痰样本培养法，其中痰涂片镜检法简单、快速和可靠，但其敏感性差；痰样本培养法是结核病诊断的金标准，但耗时长，假阴性率较高；(2)血清学诊断：结核病血清学诊断方法主要是利用免疫学技术检测血清中特异性抗Mtb的抗体。(3)结核菌素皮肤试验：是用于诊断Mtb感染所致IV型超敏反应的皮肤试验，对诊断活动性结核病和测定机体细胞免疫功能有参考价值，但其特异性差，常与环境分枝杆菌和卡介苗(BCG)产生交叉反应。(4)Mtb核酸扩增检测：该方法敏感性好，即使标本中拷贝数低的细菌也能被检出，但临床应用会有偏差，如标本处理不当，靶序列或扩增产物交叉污染等易造成假阴性。(5)IFN-γ释放试验：是结核病体外免疫检测的新方法，一般釆用酶联免疫吸附试验(ELISA)或者酶联免疫斑点实验(ELISPOT)测定机体全血或者外周血单核细胞中产生的IFN-γ的T细胞数量及细胞因子变化量，但该方法成本高，对技术要求高。以上方法中，血清学检测是体外诊断结核病的有效方法，其检测方法简单、快速、高效和低廉，成为近年来结核病诊断的研究热点。该方法通过基因工程获取重组抗原，结合间接ELISA方法检测病人血清中的特异抗体，已在结核病的血清学诊断中显示出较好的诊断价值，如ESAT-6、CFP-21、Ag85复合物等。但现有的血清学诊断方法中所用的抗原很少能同时满足高灵敏性和特异性的需求，常将两种或者多种抗原结合用于结核病血清学诊断。但是传统的用蛋白抗原用于血清学诊断方法，必须先对相关基因进行克隆表达，再用亲和层析方法对蛋白进行纯化，这样比较费时费力，并且蛋白的表达与纯化过程易受多方面因素的影响。噬菌体展示技术(Phage display technology)是由Smith等创建的一种分子生物学技术。该技术将编码外源目的蛋白或多肽的DNA片段插入到噬菌体一个特定的衣壳蛋白基因中，插入基因编码的蛋白与噬菌体的衣壳蛋白形成融合蛋白而呈现在噬菌体的表面，通过表型筛选即可获得相应的目的蛋白或多肽的DNA序列。目前，该技术广泛应用于抗原及表位筛选、细胞表面受体和蛋白质-蛋白质相互作用等领域。
技术实现思路
本专利技术解决了
技术介绍
中的不足，提供了一种能够与结核病阳性血清特异结合的多肽和展示该多肽的核心噬菌体，所述多肽和其相应的核心噬菌体的灵敏度和特异度高，具有良好的临床诊断价值。实现本专利技术上述目的所采用的技术方案为：一种能够与结核病阳性血清特异结合的多肽，所述的多肽为A和B中的一种或两种的组合，其中A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Arg-Pro，B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：Thr-Met-Gly-Phe-Thr-Ala-Pro-Arg-Phe-Pro-His-Tyr。本专利技术还提供了一种结核病血清学诊断试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，所述试剂盒中含有上述与结核病阳性血清特异结合的多肽。本专利技术还进一步提供了一种基于噬菌体展示多肽的结核病诊断试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，试剂盒中还包含有核心噬菌体P1和核心噬菌体P4，其中核心噬菌体P1为展示多肽A的噬菌体，核心噬菌体P4为展示多肽B的噬菌体。以上试剂盒中，所述包被液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6，所述的洗涤液为含0.05％Tween-20的TBST缓冲液，其pH为7.6，所述封闭液为含5％BSA的TBS缓冲液，所述的终止液为2mol/L的H2SO4溶液。将本专利技术所提供的噬菌体及其相应的多肽进行ELISA反应，结果表明：代表性噬菌体克隆均能与结核病阳性血清发生特异结合，展示核心序列A的核心噬菌体P1和展示核心序列B的核心噬菌体P4能与不同的临床血清发生结合，灵敏度分别为78.57％和72.62％，特异度分别为95.31％和93.75；固相合成的多肽A和B与不同的临床血清发生反应，其灵敏度分别为89.41％和85.88％，特异度分别为90.63％和93.75％。与现有技术相比，本专利技术中将噬菌体应用于血清学诊断具有以下显著的优势：噬菌体侵染大肠杆菌，繁殖速度快，易于实现大批量生产；噬菌体结构紧密，耐恶劣环境强，对检测的条件要求不高，使试验易于操作；敏感度和特异度高，能够达到快速、灵敏的诊断要求。因此，将噬菌体用于结核病的血清学诊断，对提高结核病的临床诊断效率具有重要意义。附图说明图1为琼脂糖凝胶电泳分析提取的部分噬菌体单链DNA图；图2为噬菌体克隆与结核病阳性血清及牛血清白蛋白的ELISA反应性图；图3为斑点免疫印迹法检测噬菌体与结核病阳性血清的特异结合图；图4为核心噬菌体P1和不同的临床血清的ELISA反应图；图5为核心噬菌体P4和不同的临床血清的ELISA反应图；图6为核心噬菌体P1和不同临床血清ELISA反应的ROC分析图；图7为核心噬菌体P4和不同临床血清ELISA反应的ROC分析图；图8为多肽A和不同的临床血清的ELISA反应图；图9为多肽B和不同的临床血清的ELISA反应图；图10为多肽A和不同临床血清ELISA反应的ROC曲线图；图11为多肽B和不同临床血清ELISA反应的ROC曲线图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做详细具体的说明，但是本专利技术的保护范围并不局限于以下实施例。本实施例中利用纯化的结核病阳性混合血清为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行3轮生物淘选，筛选到能与结核病阳性混合血清特异结合的噬菌体，然后用固相法合成噬菌体展示的外源多肽，检测噬菌体以及外源多肽与不同临床血清的反应情况，以证明该噬菌体及其多肽在结核病血清学诊断中的应用价值。主要试剂和仪器：噬菌体展示随机12肽库(The Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library)、受体菌Escherichia coli ER2738、测序引物及辣根过氧化物酶标记的抗M13pIII单克隆抗体均为美国New England Biolabs公司产品。经饱和硫酸铵法进行初步纯化的结核病阳性混合血清为课题组前期制备并保存。85份结核病阳性血清和32份结核病阴性血清来自衡阳市第三人民医院；32份肺炎支原体阳性血清和32份肺炎衣原体阳性血清来自南华大学附属第一医院检验科。特异结合噬菌体的筛选：用包被缓冲液(pH9.6的0.1M NaHCO3缓冲液)将纯化的结核病阳性混合血清稀释成100μg/mL，取150μL加入96孔微量滴定板(C本文档来自技高网...
【技术保护点】
与结核病阳性血清特异结合的多肽，其特征在于：所述的多肽为A和B中的一种或两种的组合，其中A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：Ser‑Val‑Ser‑Val‑Gly‑Met‑Lys‑Pro‑Ser‑Pro‑Arg‑Pro，B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：Thr‑Met‑Gly‑Phe‑Thr‑Ala‑Pro‑Arg‑Phe‑Pro‑His‑Tyr。
【技术特征摘要】
1.与结核病阳性血清特异结合的多肽，其特征在于：所述的多肽为A和B中的一种或两种的组合，其中A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示：Ser-Val-Ser-Val-Gly-Met-Lys-Pro-Ser-Pro-Arg-Pro，B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：Thr-Met-Gly-Phe-Thr-Ala-Pro-Arg-Phe-Pro-His-Tyr。2.一种结核病血清学诊断试剂盒，该试剂盒中至少包括包被液、洗涤液、封闭液和终止液，其特征在于所述试剂盒中含有权利要求1所述的与结核病阳性血清特异结合的多肽。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述包被液为0.05M的碳酸盐缓冲液，pH为9.6，所述的洗涤液为...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾焱华，王丽，邓湘赢，戴佩，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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