筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，采用LC/MS仪器分别对实验组A和对照组B的血清样本进行代谢组学分析，对所有样本中物质的峰的响应强度数据进行模型判别分析，分别对实验组A和对照组B进行PCA分析，并在此基础上进行PLS‑DA、OPLS‑DA的模型构建，从而获得差异性表达代谢物，筛选并鉴定与乳腺癌发生、转移相关的生物标志物：溶血性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。其结果对于阐明三阴性乳腺癌患者血清特征性代谢物含量变化规律以及代谢物在肿瘤的发生发展过程中的作用具有重要的意义；同时应用此筛选方法可以获得有效的乳腺癌早期诊断靶点，并为建立特异性癌症诊断模型提供数据基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种代谢组学对肿瘤引起机体代谢变化做出整体评价并筛选出有价值的生物标志物的方法，尤其涉及一种筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法。
技术介绍
代谢组学(metabolomics)是近年来发展起来的一项技术，用于评估生物样品在受到环境或其他因素刺激下，其中的各种小分子化合物的变化情况。肿瘤的早发现、早治疗及个性化诊疗方案是肿瘤治疗的发展方向，新兴的代谢组学开辟了辅助肿瘤早期诊断、疗效评价及预后判断的新思路。肿瘤的发生、发展伴随着机体代谢产物的变化，代谢组学能对肿瘤引起的机体代谢变化做出整体评价，筛选出有价值的生物标志物，用于肿瘤的早期诊治。但现有技术中，并没有一种筛选三阴性乳腺癌引起机体代谢变化的生物标志物的方法。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述不足，本专利技术提供了一种筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下技术方案：筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，该方法包括如下步骤：(1)选取多个三阴性乳腺癌女性患者血清作为实验组A；选取与实验组A数量相等的正常女性血清作为对照组B；(2)室温解冻实验组A和对照组B的血清后，分别精准吸取100μL血清样本在不同的1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例为样品：甲醇＝1:4，涡旋30s，进行4℃，12000rpm离心15min，吸取200μL上清液，转入的进样小瓶中待检测；>(3)将不同血清样本的小瓶分别放置在LC-Q/TOF-MS实验仪器的分析平台上进行色谱分离和质谱检测；色谱分离条件为：柱温为40℃，流速0.35mL/min；流动相组成：①实验组A为：水+0.1％甲酸；②对照组B为：乙腈+0.1％甲酸；进样量为4μL，自动进样器温度4℃；质谱条件：①采用正离子模式进行检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型，毛细管电压4kV、锥孔电压35kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4V；②负离子模式条件：毛细管电压3.5kV、锥孔电压50kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度300℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气700L/h、萃取锥孔4V；离子扫描时间0.03s、扫描时间间隔0.02s、数据采集范围：50-1000m/z；(4)通过MassProfiler软件对LC-Q/TOF-MS实验仪器获得的LC/MS数据进行预处理，并在EXCEL2010软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量和峰强；然后将所有数据归一化到总信号积分；(5)将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件进行主成分分析，获得正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值和Q2值，R2X值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(6)采用监督性的偏最小二乘方判别分析PLS-DA对两组样本进行分析，其模型质量参数为：正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值、R2Y值和Q2值；R2X值为模型的解释率，R2Y值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(7)进一步采用监督式方法OPLS-DA进行建模分析，获得正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值、R2Y值和Q2值，R2X值为模型的解释率，R2Y值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(8)采用OPLS-DA模型的VIP值，并结合t-test的p值来寻找差异性表达代谢物；差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库，比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass；筛选并鉴定与三阴性乳腺癌发生、转移相关的生物标志物为：溶血性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。作为本专利技术的一种优选方案，将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件进行主成分分析前，对数据组进行归一化处理。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1、在利用高通量、高灵敏度、快速的LC-Q/TOF-MS技术，对三阴性乳腺癌患者以及正常人的血清进行代谢组学分析并比对，从而寻找乳腺癌早期诊断的特异性的血清代谢标志物。其结果对于阐明三阴性乳腺癌患者血清特征性代谢物含量变化规律以及代谢物在肿瘤的发生发展过程中的作用具有重要的意义。2、应用此筛选方法可以获得有效的乳腺癌早期诊断靶点，并为建立特异性癌症诊断模型提供数据基础。附图说明图1为实验组A单个样本离子流色谱图(A:pos,B:neg)；图2为A-B及QC的PCA得分图(pos)；图3为A-B及QC的PCA得分图(neg)；图4为A-B两组的PLS-DA得分图(pos)；图5为图4对应的A-B两组的PLS-DA排序验证图(pos)；图6为A-B两组的PLS-DA得分图(neg)；图7为图6对应的A-B两组的PLS-DA排序验证图(neg)；图8为A-B两组的OPLS-DA得分图(pos)；图9为A-B两组的OPLS-DA得分图(neg)。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细地描述。筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，该方法包括如下步骤：(1)选取多个三阴性乳腺癌女性患者血清作为实验组A；选取与实验组A数量相等的正常女性血清作为对照组B。本实施例中，分析了31例三阴性乳腺癌女性患者血清，并以31例正常女性血清为对照。(2)室温解冻实验组A和对照组B的血清后，分别精准吸取100μL血清样本在不同的1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例为样品：甲醇＝1:4，涡旋30s，进行4℃，12000rpm离心15min，吸取200μL上清液，转入进样小瓶中待检测。甲醇为HPLC级甲醇，购自Merck公司(Dannstadt，Gennany)。(3)将不同血清样本的小瓶分别放置在LC-Q/TOF-MS(Agilent,1290InfinityLC,6530UHDandAccurate-MassQ-TOF/MS)实验仪器的分析平台上进行色谱分离和质谱检测；分离色谱柱为C18色谱柱(Agilent,100mm×2.1mm，1.8μm)。色谱分离条件为：柱温为40℃，流速0.35mL/min；流动相组成：①实验组A为：水+0.1％甲酸；②对照组B为：乙腈+0.1％甲酸；梯度洗脱程序见表1。进样量为4μL，自动进样器温度4℃。甲酸购自CNW公司，水为屈臣氏蒸馏水。表1.Thegradientofmobilephase质谱条件：①采用正离子模式进行检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型。正本文档来自技高网...

【技术保护点】
筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)选取多个三阴性乳腺癌女性患者血清作为实验组A；选取与实验组A数量相等的正常女性血清作为对照组B；(2)室温解冻实验组A和对照组B的血清后，分别精准吸取100μL血清样本在不同的1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例为样品：甲醇＝1:4，涡旋30s，进行4℃，12000rpm离心15min，吸取200μL上清液，转入进样小瓶中待检测；(3)将不同血清样本的小瓶分别放置在LC‑Q/TOF‑MS实验仪器的分析平台上进行色谱分离和质谱检测；色谱分离条件为：柱温为40℃，流速0.35mL/min；流动相组成：①实验组A为：水+0.1％甲酸；②对照组B为：乙腈+0.1％甲酸；进样量为4μL，自动进样器温度4℃；质谱条件：①采用正离子模式进行检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型，毛细管电压4kV、锥孔电压35kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4V；②负离子模式条件：毛细管电压3.5kV、锥孔电压50kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度300℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气700L/h、萃取锥孔4V；离子扫描时间0.03s、扫描时间间隔0.02s、数据采集范围：50‑1000m/z；(4)通过Mass Profiler软件对LC‑Q/TOF‑MS实验仪器获得的LC/MS数据进行预处理，并在EXCEL 2010软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量和峰强；然后将所有数据归一化到总信号积分；(5)将编辑后的数据矩阵导入SIMCA‑P软件进行主成分分析，获得正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值和Q2值，R2X值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(6)采用监督性的偏最小二乘方判别分析PLS‑DA对两组样本进行分析，其模型质量参数为：正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值、R2Y值和Q2值；R2X值为模型的解释率，R2Y值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(7)进一步采用监督式方法OPLS‑DA进行建模分析，获得正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值、R2Y值和Q2值，R2X值为模型的解释率，R2Y值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(8)采用OPLS‑DA模型的VIP值，并结合t‑test的p值来寻找差异性表达代谢物；差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库，比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass；筛选并鉴定与三阴性乳腺癌发生、转移相关的生物标志物为：溶血性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。...

【技术特征摘要】
1.筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，其特征在于，该方法包括如下步
骤：
(1)选取多个三阴性乳腺癌女性患者血清作为实验组A；选取与实验组A数量相等的正
常女性血清作为对照组B；
(2)室温解冻实验组A和对照组B的血清后，分别精准吸取100μL血清样本在不同的
1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，其比例为样品：甲醇＝1:4，涡旋30s，进行4℃，12000rpm
离心15min，吸取200μL上清液，转入进样小瓶中待检测；
(3)将不同血清样本的小瓶分别放置在LC-Q/TOF-MS实验仪器的分析平台上进行色谱
分离和质谱检测；
色谱分离条件为：柱温为40℃，流速0.35mL/min；流动相组成：①实验组A为：水+0.1％
甲酸；②对照组B为：乙腈+0.1％甲酸；进样量为4μL，自动进样器温度4℃；
质谱条件：①采用正离子模式进行检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模
式V型，毛细管电压4kV、锥孔电压35kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气
流50L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4V；②负离子模式条件：毛细管电压3.5kV、锥孔电压
50kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度300℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气700L/h、萃取
锥孔4V；离子扫描时间0.03s、扫描时间间隔0.02s、数据采集范围：50-1000m/z；
(4)通过MassProfiler软件对L...

【专利技术属性】
技术研发人员：辇伟奇，李丽仙，郑晓东，易琳，张海伟，林昌海，刘兴明，
申请(专利权)人：重庆市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：重庆;85