一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL及其制备方法技术

本发明专利技术采用具有定向靶向的纳米脂质体负载肿瘤相关性抗原WT1制备抗原特异性T淋巴细胞。本发明专利技术制备肿瘤相关性抗原特异性T淋巴细胞技术不仅采用新型纳米脂质体负载肿瘤相关性抗原，以肿瘤相关性为治疗的靶目标，能够诱导更有效的靶向杀伤肿瘤相关性的特异性细胞毒性T淋巴细胞，直接针对肿瘤发生和复发的根源，使肿瘤治疗更具有“治本”性；采用72小时快速成熟树突状细胞，大大缩短肿瘤患者最佳治疗的时间窗口；同时采用工程细胞放大扩增抗原特异性T淋巴细胞，能产生高比例的杀伤能力更强的Tcm。本发明专利技术肿瘤相关性抗原WT1特异性T淋巴细胞制备方法简便易行，免疫靶点针对肿瘤相关性，抗原性强且稳定性良好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生命科学
，尤其涉及一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL及其制备方法。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁人类生命健康的第二大致死因素。据统计，2008年全球新发恶性肿瘤患者1270万例，死亡760万例。恶性肿瘤的发生和侵袭转移过程受多层次、多因素调控，癌基因与抑癌基因作用的失衡是其中的关键环节之一。因此，寻找新的或进一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能，对阐明恶性肿瘤发生和演进机理、研发潜在治疗靶点具有重要意义。Wilms瘤基因1(Wilms’tumorgene1，WT1)首先在肾母细胞瘤(又称Wilms瘤)中作为抑癌基因被克隆鉴定，位于人11号染色体短臂1区3带，长约50kb，有10个外显子，富含“GC”同源序列。WT1基因编码产物为长约52-54kD的蛋白质。正常生理情况下，WT1主要在胚胎发生过程中表达，参与心脏、肾脏和脾脏等器官的形成。WT1在正常成体组织中表达部位局限且表达强度极低。WT1在成体组织中的异常表达与多种恶性肿瘤的发生密切相关，但根据细胞特征不同，其可发挥癌基因或抑癌基因作用。一方面，在Wilms瘤等儿童恶性肿瘤中，WT1通过干扰细胞增殖信号等途径抑制细胞生长，发挥抑癌基因作用；另一方面，WT1可增强肿瘤细胞的抗凋亡能力，并通过调控原癌基因K-ras增强细胞的增殖能力，提示WT1亦可发挥癌基因作用。WT1基因是一种肿瘤相关性抗原(tumorassociatedantigen,TAA)，在各型白血病有高水平表达，此外在多种实体瘤包括肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、食道癌、肝细胞癌和胃肠间质瘤等实体瘤中都有过表达，并且表达水平与预后呈负相关。WT1表达水平增高可促进细胞生长、凋亡受抑和诱导WT1转基因小鼠产生白血病；反义寡核苷酸抑制WT1表达或SiRNA沉默WT1后能使白血病细胞及实体瘤细胞生长停止，表明WT1在白血病和实体瘤的发展中担当着癌基因角色。根据以上发现，表明WT1是免疫治疗的理想靶抗原。而且最近美国国家癌症研究所根据疗效、免疫原性等标准评估了包括WT1在内的75个肿瘤抗原，WT1排名第一，被评为免疫治疗的首选靶抗原。此外，研究发现白血病细胞高表达WT1，表明基于WT1的免疫治疗，有望靶向杀死肿瘤细胞，进一步证明了WT1作为肿瘤免疫治疗优越性。为今后肿瘤患者的治疗和预后预测提供理论依据。在人类抗癌历史上，与癌症抗争有过三大利器：外科手术，化疗，与放射治疗。至此，免疫科学家斯坦曼利用先前发现的树突状细胞(Dendriticcell,DC)，激发自身的免疫力清除肿瘤，利用自己的研究成果，将生命由预期的数月延长到四年。由于他对免疫领域的贡献在2011年获得诺贝尔生理医学奖，在肿瘤领域并开创了一个新的天地——肿瘤免疫细胞治疗。他的研究成果现在已经广泛应用于临床，已经成为继手术、放、化疗后的第四种癌症治疗方式。由于肿瘤免疫细胞治疗能够联合手术、化疗、放疗精准清除残余肿瘤细胞，防止复发和转移，加强免疫监视作用，提升患者生存质量和时间，并且没有放化疗的毒副作用和手术的巨大伤害。近年来，在临床应用中受到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点，已被公认为是最具前景的肿瘤治疗方法。过继性免疫细胞治疗是指通过输入自身或同种异体的肿瘤杀伤细胞来治疗肿瘤的方法。它不仅可以纠正细胞免疫功能的低下，促进宿主抗肿瘤免疫的功能，还可以直接发挥抗肿瘤的作用。其中细胞毒性T细胞的过继治疗有着特殊的优越性。细胞毒性T细胞的过继治疗是实体肿瘤，尤其是肿瘤相关抗原比较明确的恶性黑色素瘤、结直肠癌、肝癌、前列腺癌、肺癌等的研究热点。特异性CTLs(细胞毒性T细胞)的产生是通过将肿瘤抗原负载成熟的DC(树突状细胞)刺激T细胞从而获得抗原的特异性CTLs克隆。这种CTL能识别并杀伤携带相应肿瘤抗原的恶性细胞，经过大量的扩增就能应用于临床治疗。这种治疗方法相比其他的治疗方法具有易获得、可操作性强，靶向性好，安全性高等特点。但是，过继性T细胞转移还面临很多的问题：DC的成熟程度低，免疫耐受，特异性活化T细胞的数量不足等等。由于DC扩增具有很大的难度，所以这也间接限制了特异性活化T细胞的数量。以树突状细胞(Dendriticcell,DC)疫苗为代表的肿瘤免疫治疗成为继手术、化疗、和放疗后的第四种抗肿瘤疗法，主要利用肿瘤细胞的抗原物质刺激机体产生特异性肿瘤细胞免疫杀伤，从而达到消灭肿瘤的目的。与传统的抗肿瘤治疗相比，DC疫苗介导的免疫治疗具有安全性好、特异性高等诸多优点，目前已被广泛用于治疗肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等各类恶性肿瘤，然而其临床疗效仍有待进一步提高。树突状细胞(DC)作为体内功能最强的抗原递呈细胞，是激发机体产生抗肿瘤免疫应答的首要核心环节。它能摄取抗原，并将抗原信息通过MHC-I类分子提呈给CD8+T淋巴细胞，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)生成，继而杀死肿瘤细胞，适用于多种肿瘤的免疫疗法。因此，提高DC对抗原的摄取量和提呈能力是增强其临床疗效的重要策略。纳米级脂质体是由磷脂双层壳包裹水相核心形成的球形的实体，其结构类似生物膜,是一种生物相容性好且无毒的纳米材料。它可包封水溶性和脂溶性药物,具有减少药物剂量、缓释、及靶向性释放药物等优点，因而被广泛用于纳米级抗肿瘤药物的开发。此外，纳米级脂质体也是一种优良的抗原载体，不仅能够包裹一系列理化性质不同的抗原及免疫佐剂，保护蛋白多肽抗原不被降解，还可以促进抗原呈递细胞对抗原的吞噬及呈递，提高机体的特异性免疫反应。基于以上这些优点，纳米级脂质体作为一种新型的疫苗载体，正逐渐用于细菌疫苗、病毒疫苗、抗寄生虫疫苗以及抗肿瘤疫苗等研制开发。中性脂质体和表面携带正电荷的阳离子纳米级脂质体是最常用的纳米疫苗载体。其中特别值得关注的是阳离子纳米级脂质体，它不但是优良的蛋白/多肽抗原载体，还是一种新型的免疫佐剂，可直接活化抗原呈递细胞，增强疫苗诱导的免疫反应。目前肿瘤的细胞免疫治疗效果仍不理想，主要原因包括如下两方面：1)肿瘤患存在免疫抑制的微环境，一方面，肿瘤组织的T淋巴细胞产生免疫耐受，另一方面，肿瘤细胞能够分泌多种免疫抑制因子，诱导产生调节性T淋巴细胞或抑制DCs功能。2)肿瘤免疫治疗中应用的抗原大多表达在已分化的肿瘤细胞上，而肿瘤相关并不表达这些抗原，所诱发的免疫杀伤反应并不针对肿瘤相关。加上目前常规DC加入患者肿瘤细胞裂解得到的肿瘤抗原，使DC负载肿瘤抗原，虽然这种方法能使得DC摄取到患者的肿瘤抗原，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，制备包裹有肿瘤相关抗原WT1的靶向树突状细胞C‑型凝集素受体的阳离子脂质体载体；步骤二，利用所述步骤一得到的阳离子脂质体载体将肿瘤相关抗原WT1负载于成熟DC细胞；步骤三，利用所述步骤二得到的成熟DC细胞诱导得到WT1特异性T淋巴细胞和中枢性记忆性T淋巴细胞。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤相关抗原WT1特异性CTL的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，制备包裹有肿瘤相关抗原WT1的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂
质体载体；
步骤二，利用所述步骤一得到的阳离子脂质体载体将肿瘤相关抗原WT1负载于成熟DC
细胞；
步骤三，利用所述步骤二得到的成熟DC细胞诱导得到WT1特异性T淋巴细胞和中枢性记
忆性T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中具体包括以下步骤：
步骤1，提供聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂，将C-型凝集素类型的糖连接在聚乙二醇衍生
化乙醇胺磷脂，得到C-型凝集素类型的糖修饰的聚乙二醇衍生化乙醇胺磷脂；
步骤2，将阳离子脂和步骤1中得到的C-型凝集素类型的糖修饰的聚乙二醇衍生化乙醇
胺磷脂分别溶解于氯仿和甲醇的混合溶剂中，得到混合液；
步骤3，用旋转蒸发仪将步骤2中得到的混合液旋转蒸干，使之形成一层均匀的薄膜，真
空干燥后加入含有肿瘤相关抗原WT1的PBS缓冲液或纯水放置4℃超声水化，挤压过膜后得
到包裹有肿瘤相关抗原WT1的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂质体载体。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中具体包括以下步骤：
步骤1，将外周血单个核细胞悬于基础培养基并加入DC细胞诱导培养基，种于细胞培养
板，在37℃，5％CO2，饱和湿度下培养进行DC细胞诱导；
步骤2，向DC细胞中加入适量的所述步骤一得到负载有肿瘤相关抗原WT1的阳离子脂质
体载体，共孵育培养6小时；然后加入DC促成熟培养基，继续培养24-48小时，即得到负载肿
瘤相关抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈尚，刘根桃，李晓祥，
申请(专利权)人：深圳市中美康士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44