本发明专利技术公开了一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，该方法包括如下步骤：在粒径为30‑100µm、密度为1.16‑3g/mL的羟基微球表面化学键合上一层20‑100nm厚的明胶，得到包裹明胶的羟基微球；在包裹明胶的羟基微球表面修饰上抗体anti‑EpCAM和anti‑CD146；将病人血样与修饰抗体的羟基微球混匀孵育得混合样品，滴加到1.15‑1.20g/mL细胞分离液的上层，离心分离后，捕获住肿瘤细胞的微球沉积在细胞分离液底部；将捕获住肿瘤细胞的微球使用明胶酶降解微球表面明胶，释放肿瘤细胞。本发明专利技术分选效率及纯度更高，并且分选出来的肿瘤细胞能够被释放及培养。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤细胞分选方法，具体涉及一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法。
技术介绍
循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）是从原发肿瘤组织上脱离下来进入到肿瘤患者外周血中的肿瘤细胞，对于肿瘤的早期诊断和治疗评估有很重要的临床研究价值。鉴于实体肿瘤患者因癌症导致死亡的原因多数是因肿瘤转移这个事实，以及血液循环系统中监测到CTCs将预示着肿瘤向远处转移的可能性，早期的循环肿瘤细胞诊断在人体肿瘤活组织检查和判断疾病进展中起着关键作用。然而，血液循环系统中的CTCs含量是极低的，转移癌患者体内每毫升血液中只有几个到几百个CTCs，却存在着109个干扰血细胞，因此对于CTCs的富集分选是一个非常大的技术挑战。CTCs的分选效果（分选效率以及分选纯度）直接影响了其对病人肿瘤诊断的预判以及后续的基因检测等，因此高的分选灵敏度、高的分选纯度、高通量以及高的CTCs活性的细胞分选成为近年来的研究热点和难点。近年来，越来越多的灵敏的、具有特异性的CTCs的捕获与鉴定技术已经逐渐发展成熟。目前，CTCs的分选机理最常用的是利用特异性抗体对其表面表达的肿瘤标记物，如上皮细胞粘附因子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM），进行特异性的抗原-抗体吸附达到细胞分选的目的。这些特异性识别方法均依赖于CTCs表面的EpCAM抗原表达的情况，然而研究发现，肿瘤细胞在迁移过程中会出现上皮-间质转换（epithelia-mesenchymal transition, EMT）过程，在这个过程中CTCs表面的EpCAM或者CK抗原的表达会降低，而这些EpCAM阴性的CTCs可以揭示肿瘤转移的机理，而这些很重要的CTCs将会被基于anti-EpCAM抗体的捕获方法所遗失，导致了较低的CTC捕获效率。其次应用较为广泛的是利用CTCs与其他血细胞的物理特性差异进行非特异性的分选，如细胞尺寸、密度和形变等的差异性。其中密度梯度离心法，因其成本低廉和操作简单的优势而被应用在患者外周血CTCs的探测中。根据不同种类的细胞密度不同（其中CTCs密度范围为1.06-1.11g/mL，红细胞密度范围为1.10-1.15g/mL，白细胞密度范围为1.07-1.09g/mL），利用密度梯度离心法将细胞按照不同密度分布在离心液中。然而这种方法只能去除血样中大量的红细胞，由于CTCs与白细胞的密度有交叉部分，在离心分选过程中，CTCs可能会与白细胞共沉积，导致纯度、灵敏度降低。因此本专利技术在抗原-抗体特异性识别技术和密度梯度离心技术的基础上引入了一种新的更有效的基于密度大小的细胞分选技术。本专利技术添加了一种新的肿瘤标记物CD146，来加强CTCs的捕获。作为EMT的诱导因子，CD146跟肿瘤细胞表面EpCAM的表达呈互补关系，故使用anti-CD146抗体可以捕获到EpCAM阴性表达的CTCs，尤其已经经历过EMT过程的CTCs。本专利技术通过特异性识别选择性的增大CTC密度，从而扩大其与血细胞密度的差异性，使用一种优化的特定密度的细胞分离液对处理过的血样进行分层，提高CTC分选纯度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，该方法基于抗原-抗体特异性识别技术和密度梯度离心技术，其分选效率及纯度更高，并且分选出来的肿瘤细胞能够被释放及培养。为了达到以上目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，包括如下步骤：（1）配制密度为1.15-1.20g/mL的细胞分离液。所述的细胞分离液包括Ficoll或Percoll细胞分离液。（2）在粒径为30-100µm、密度为1.16-3g/mL的羟基微球表面化学键合上一层20-100nm厚的明胶，得到包裹明胶的羟基微球。所述的羟基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA微球。（3）在包裹明胶的羟基微球表面修饰上具有特异性免疫识别肿瘤细胞功能的抗体anti-EpCAM和anti-CD146，得到双抗体修饰的羟基微球。（4）将病人血样与双抗体修饰的羟基微球混匀孵育（使微球表面修饰的抗体与肿瘤细胞表面抗原特异性结合以捕获住肿瘤细胞）得混合样品，将混合样品缓慢滴加到1.15-1.20g/mL细胞分离液的上层，离心分离后，上述微球处理过的血样被分层，其中所有的血细胞悬浮在细胞分离液上方，所有的捕获住肿瘤细胞的微球（CTC-beads）沉积在细胞分离液底部，从而将外周血样中的CTC-beads完全从周围的血细胞中分离出来，得到非常高的CTC-beads纯度。（5）将收集的捕获住肿瘤细胞的微球使用明胶酶降解微球表面明胶，释放肿瘤细胞。步骤（1）中所述的Percoll细胞分离液的密度优选为1.15g/mL。从美国Sigma公司购买的Percoll原液的密度是1.13g/mL，通过使用1.316g/mL的蔗糖溶液以体积比1:9的比例浓缩密度为1.13g/mL的Percoll原液得到密度为1.15g/mL 的Percoll细胞分离液。步骤（2）中所述的羟基微球优选为粒径为50µm、密度1.2g/mL的二氧化硅微球。所述的羟基微球为二氧化硅微球时，步骤（2）优选包括如下步骤：1）将二氧化硅微球加入到无水乙醇中，加热升温至60℃后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-Aminopropyltriethoxysilane, APS）磁力搅拌2-4h，然后经过无水乙醇、去离子水离心冲洗后得到了氨基修饰的二氧化硅微球（NH2-SiO2）。2）将NH2-SiO2重新分散到去离子水中，加入戊二醛，室温下搅拌5-20h，然后经过去离子水离心冲洗后得到了醛基修饰的二氧化硅微球（CHO-SiO2）。3）将CHO-SiO2再次分散到明胶溶液，室温下搅拌3-12h后用去离子水离心洗涤去除未反应完全的明胶溶液得到表面均匀包裹上一层厚明胶的二氧化硅微球（SiO2@Gel）。步骤（3）优选包括如下步骤：1）使用EDC/NHS对包裹明胶的羟基微球表面羧基进行活化30-120min，使用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Solution, PBS）离心清洗3次。2）将1）处理的微球浸入到链霉亲和素（streptavidin, SA）溶液中，反应40-120min在微球表面引入链霉亲和素，PBS离心清洗3次。3）将2）处理的微球加入到生物素化的anti-EpCAM和anti-CD146抗体溶液中，室温下反应1-3h，用PBS漂洗得到双抗体修饰的羟基微球。步骤（4）混合样品中双抗体修饰的羟基微球的数量优选为1.5×105/mL。步骤（4）中离心所用离心力优选为40-400g。在步骤（4）中，密度为1.2g/mL的二氧化硅微球特异性地捕获CTCs，使用将得到密度>1.2g/mL的CTC-bead，使用密度为1.15g/mL的Percoll溶液对血样进行分层，在这个密度下，红细胞很难沉降，离心后，所有血细胞悬浮在Percoll溶液上层，CTC-beads沉降在最底层，彻底地跟所有的血细胞区分开来。步骤（5）中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)配制密度为1.15‑1.20g/mL的细胞分离液；所述的细胞分离液包括Ficoll或Percoll细胞分离液；(2)在粒径为30‑100μm、密度为1.16‑3g/mL的羟基微球表面化学键合上一层20‑100nm厚的明胶，得到包裹明胶的羟基微球；所述的羟基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球；(3)在包裹明胶的羟基微球表面修饰上抗体anti‑EpCAM和anti‑CD146，得到双抗体修饰的羟基微球；(4)将病人血样与双抗体修饰的羟基微球混匀孵育得混合样品，将混合样品滴加到1.15‑1.20g/mL细胞分离液的上层，离心分离后，捕获住肿瘤细胞的微球沉积在细胞分离液底部；(5)将收集的捕获住肿瘤细胞的微球使用明胶酶降解微球表面明胶，释放肿瘤细胞。
【技术特征摘要】
1.一种基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)配制密度为1.15-1.20g/mL的细胞分离液；所述的细胞分离液包括Ficoll或Percoll细胞分离液；(2)在粒径为30-100μm、密度为1.16-3g/mL的羟基微球表面化学键合上一层20-100nm厚的明胶，得到包裹明胶的羟基微球；所述的羟基微球包括二氧化硅微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球；(3)在包裹明胶的羟基微球表面修饰上抗体anti-EpCAM和anti-CD146，得到双抗体修饰的羟基微球；(4)将病人血样与双抗体修饰的羟基微球混匀孵育得混合样品，将混合样品滴加到1.15-1.20g/mL细胞分离液的上层，离心分离后，捕获住肿瘤细胞的微球沉积在细胞分离液底部；(5)将收集的捕获住肿瘤细胞的微球使用明胶酶降解微球表面明胶，释放肿瘤细胞。2.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，其特征在于：步骤(1)中所述的细胞分离液为的密度为1.15g/mL的Percoll细胞分离液。3.根据权利要求2所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，其特征在于：密度为1.15g/mL的Percoll细胞分离液通过使用1.316g/mL的蔗糖溶液以体积比1:9的比例浓缩密度为1.13g/mL的Percoll原液得到。4.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，其特征在于：步骤(2)中所述的羟基微球是粒径为50μm、密度为1.2g/mL的二氧化硅微球。5.根据权利要求1所述的基于双抗及细胞密度的高特异性高纯度的肿瘤细胞分选方法，其特征在于：所述的羟基微球为二氧化硅微球时，步骤(2)包括如下步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵兴中，黄琴琴，蔡博，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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