本发明专利技术公开了一种高转移胰腺癌细胞株及其构建方法和应用。胰腺癌细胞株，命名为人胰腺癌细胞系BxPC‑3M8，保藏号为：CCTCC NO：C2016119。本发明专利技术通过将胰腺癌细胞株BxPC‑3反复8次进行Transwell穿膜实验，筛选得到了BxPC‑3M8细胞系，该细胞系具有高转移性和侵袭性，能够被用于制备哺乳动物胰腺癌模型，研究胰腺癌细胞转移机制，提取胰腺癌转移和复发的标志物，筛选和评估治疗胰腺癌药物，开发胰腺癌复发检测试剂盒等用途，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学和肿瘤学领域，特别是涉及一种高转移胰腺癌细胞株及其构建方法和应用。
技术介绍
癌症是严重威胁我国人民生命健康的第一大“杀手”，已成为亟待解决的公共健康问题！最新研究提示我国癌症新发病例和死亡病例逐年增加，其中2015年约有429.2万新发浸润性癌症病例，平均每天新发约12000例；有281.4万癌症死亡病例，平均每天约7500人死于癌症。胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一。胰腺癌发病率在全球范围内呈逐年上升趋势，年轻化、病程短、进展快、预后差、死亡率高是胰腺癌的临床及生物学特征。我国胰腺癌的年发病率为5.1/10万，较20年前大幅升高。由于缺乏早期诊断和有效的治疗方法，中晚期胰腺癌的中位生存期仅有3～4个月，胰腺癌患者5年生存率低于5％，又被成为“癌症之王”。研究已经证实肿瘤转移是胰腺癌患者的主要死因。对胰腺癌侵袭、转移机制的研究一直都是热点问题，而建立良好的细胞实验模型是研究胰腺癌侵袭转移机制的重要方法。但目前缺少理想的体外研究细胞模型，制约科研工作者进一步深入研究胰腺癌转移，亟需建立和鉴定合适的高转移胰腺癌细胞模型。肿瘤细胞具有异质性。由生物学特性和侵袭转移力不完全相同的肿瘤细胞亚群组成。而肿瘤的侵袭转移能力取决于异质性的母系群体中少数高转移能力的细胞，通过多次筛选，某些高转移亚系细胞可以稳定下来。同时，不适应和不稳定亚系被去除，获得的是较稳定的具有较强侵袭转移能力的亚系。这为研究肿瘤侵袭转移机制提供了理想的细胞模型。以往大部分研究者都是通过动物体内筛选的方法筛选出肿瘤细胞亚系。但这种方法耗时长，操作难度大，重复性差，成功率较低。但目前缺少理想的体外研究细胞模型，制约科研工作者进一步深入研究胰腺癌转移。建立和鉴定合适的高转移胰腺癌细胞模型，有助于筛选胰腺癌复发转移的关键靶点，为成功开发抗复发转移的临床治疗手段提供新策略，有着重要的科学意义和临床价值！
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有高转移性和侵袭性的胰腺癌细胞株。一种胰腺癌细胞株，命名为人胰腺癌细胞系BxPC-3M8，保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年6月3日，保藏号为：CCTCC NO：C2016119。本专利技术又提供了所述胰腺癌细胞株的子代细胞。所述子代细胞基本或全部保留了亲代胰 腺癌细胞系BxPC-3M8的特性，也是具有高转移性和侵袭性的。本专利技术还提供了一种所述胰腺癌细胞株的构建方法，所述构建方法为Transwell迁移试验法，起始细胞株为胰腺癌细胞BxPC-3，试验重复次数为8次。将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。通过将亲代胰腺癌细胞多次重复Transwell迁移试验，能够筛选驯化得到高转移的胰腺癌细胞。BxPC-3细胞源自一个日本女性胰腺癌活检标本，由Tan MH等人在1982年建立的人胰腺癌细胞系，是目前胰腺癌研究中常用的细胞模型。STR(短串联重复序列)是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列，通常采用PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测。通过STR检测分析发现，BxPC-3M8与亲代BxPC-3完全同源，不存在其他细胞的交叉污染，细胞形态和增殖速度没有显著区别。但是BxPC-3M8的迁移和侵袭能力显著强于BxPC-3细胞。本专利技术还提供了所述的胰腺癌细胞株在制备哺乳动物胰腺癌模型中的应用。所述的哺乳动物为裸小鼠或裸大鼠。通过将一定细胞数量的所述胰腺癌细胞BxPC-3M8接种于裸小鼠或裸大鼠的皮下、腹腔或者尾静脉等部位，获得高转移性胰腺癌的动物模型。本专利技术还提供了所述的胰腺癌细胞株在提取胰腺癌转移和复发的标志物中的应用。通过与低转移性胰腺癌细胞进行比较研究，可以发现高转移胰腺癌的分子标记，针对该分子标记可以进行后续的药物开发等应用。本专利技术还提供了所述的胰腺癌细胞株在筛选和评估治疗胰腺癌药物中的应用。首先，通过向所述胰腺癌细胞BxPC-3M8培养基中添加不同药物，观察细胞状态变化，获得初步有效的候选药物。然后，将候选药物施药于上述高转移性胰腺癌动物模型，观察与未施药组动物的存活期、肿瘤大小、转移情况等，筛选获得潜在治疗胰腺癌的药物。本专利技术还提供了所述的胰腺癌细胞株在开发胰腺癌复发检测试剂盒中的应用。可以采用蛋白组学技术，分析比较亲代BxPC-3细胞和高转移胰腺癌细胞系BxPC-3M8分泌蛋白质的差异表达，筛选出与胰腺癌肝转移相关的分泌蛋白质，开发出检测高转移胰腺癌特定分泌蛋白表达情况的检测试剂盒，该试剂盒可用于检测胰腺癌转移和复发情况。本专利技术通过将胰腺癌细胞株BxPC-3反复8次进行Transwell穿膜实验，筛选得到了BxPC-3M8细胞系，该细胞系具有高转移性和侵袭性，能够被用于制备哺乳动物胰腺癌模型，研究胰腺癌细胞转移机制，提取胰腺癌转移和复发的标志物，筛选和评估治疗胰腺癌药物，开发胰腺癌复发检测试剂盒等用途，具有较高的科研和生产应用的价值，预期能产生良好的科研、经济和社会效益。附图说明图1为实施例2中BxPC-3和BxPC-3M8细胞形态检测图；图2为实施例4中BxPC-3和BxPC-3M8细胞的生长曲线检测结果图；图3为实施例5中BxPC-3和BxPC-3M8细胞的划痕实验结果比较图；图4为实施例6中BxPC-3和BxPC-3M8细胞的迁移实验结果比较图；图5为实施例7中BxPC-3和BxPC-3M8细胞的侵袭实验结果比较图。具体实施方式实验材料： 细胞株：胰腺癌细胞株BxPC-3，胰腺癌细胞BxPC-3M8。试剂耗材：1640培养液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)、0.25％胰酶(杭州吉诺生物医药技术有限公司)、胎牛血清(Gibco公司)、Giemsa染色试剂盒(南京建成生物科技有限公司)、60mm和100mm培养皿(Corning公司)、6孔和24孔Transwell小室(孔径8μm，corning公司)、基质胶(Matrigel)。基础培养液：含10％胎牛血清的1640培养液。无血清培养液：1640培养液。仪器：正置显微镜、倒置显微镜、细胞培养箱、超净工作台、血球细胞计数器。实施例1 BxPC-3M8细胞系建立将胰腺癌细胞株BxPC-3用1640培养液(无血清培养基)制备1×106/mL单细胞悬液，然后在孔径为8μm的6孔板Transwell小室的上室加1mL所述单细胞悬液，下室加2mL基础培养液，培养48h后，收集穿过Transwell小室隔膜的细胞，扩增培养。重复上述操作8次后，获得BxPC-3M8细胞。实施例2细胞形态学检测将10万个BxPC-3和BxPC-3M8细胞接种于60mm培养皿，培养基为基础培养液，培养72小时，至60％～70％贴壁率，去培养液，PBS洗涤2次，Giemsa染色(完全按照试剂盒操作说明)，正置显微镜下观察，拍照。如图1所示，与亲代细胞BxPC-3比较，BxPC-3M8的细胞大小、细胞轮廓等差异不大，但是细胞克隆相对松散，细胞间隙较大。实施例3 B本文档来自技高网...
【技术保护点】
胰腺癌细胞株，其特征在于，命名为人胰腺癌细胞系BxPC‑3M8，保藏号为：CCTCC NO：C2016119。
【技术特征摘要】
1.胰腺癌细胞株，其特征在于，命名为人胰腺癌细胞系BxPC-3M8，保藏号为：CCTCC NO：C2016119。2.如权利要求1所述的胰腺癌细胞株的子代细胞。3.如权利要求1所述胰腺癌细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法为Transwell迁移试验法，起始细胞株为胰腺癌细胞BxPC-3，试验重复次数为8次。4.如权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋东海，陈炳洁，谢海洋，周琳，郑树森，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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