本发明专利技术公开了一种TCR
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体地说涉及一种TCR-/PD-1-双阴性T细胞及其构建方法。
技术介绍
随着免疫学的发展，肿瘤免疫治疗取得巨大进步。肿瘤免疫治疗通过激发或调动患者自身的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞，被认为是继手术、放疗、化疗后第4大肿瘤治疗技术。近20年来，以过继细胞免疫疗法（adoptive cell therapy，ACT）和免疫检查点疗法（immune chenkpoint therapy）疗法为代表的肿瘤免疫治疗取得了突破性进展，显示出良好的应用前景，标志着肿瘤治疗新时代的开启。过继细胞免疫疗法（ACT）是将活化的具有杀伤性的免疫细胞输给肿瘤病人，使其获得抗肿瘤免疫力，以达到治疗肿瘤的目的。过继细胞免疫疗法主要包括非特异性的淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer，LAK）疗法、细胞因子介导的杀伤细胞（cytokine-induced killer ，CIK）疗法和特异性的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes ，TIL）疗法、细胞毒性T细胞（cytotoxic T-lymphocyte ，CTL）疗法、T细胞受体（T cell receptors，TCR）疗法（TCRT）、嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptors，CAR）修饰的T细胞疗法（CART）。其中CART是研究的主要重点。LAK细胞是利用白细胞介素-2（IL-2）刺激外周血单核细胞而得到的多种淋巴细胞的混合细胞。由于LAK需要使用大剂量的IL-2，毒副作用大，而且LAK细胞体外扩增能力较低。不能特异性聚集在肿瘤细胞表面，体内杀瘤活性不高，限制了临床应用。CIK是在体外将人外周血单核细胞利用多种细胞因子（如CD3单抗、IL-2、IFN-γ等）诱导而成的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，理论上兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。但是，目前CIK疗法仅对很少的病人具有一定的效果，总体疗效不好。TIL是从病人体内取出肿瘤组织，分离出其中的淋巴细胞经IL-2诱导扩增，然后回输病人体内增强免疫应答。TIL具有较高的特异性，杀瘤效果高于LAK和CIK。但是，TIL疗法面临2大难题：首先，病人在接受治疗之前，需要等待4-6周以扩增细胞；其次，需要从新鲜肿瘤组织分离，限制了其临床应用。CTL是在体外将人外周血单核细胞利用靶细胞抗原和淋巴因子的诱导、分化、扩增成具有强大杀伤能力的细胞，然后回输体内达到特异性清除病毒和杀伤肿瘤细胞的作用。但是肿瘤微环境会诱导CD8+ T细胞升高抑制性受体PD-1的表达。肿瘤通过细胞表面PD-L1与之结合，显著抑制CD8+ CTL清除肿瘤细胞的能力。大量的基础研究和临床实验表明抗PD-1或抗PDL-1的抗体能显著增强机体清除肿瘤的效率，因此通过敲除CTL的PD-1、PDL-1基因可能是提高CTL免疫治疗效果一个有效途径。TCRT是通过基因工程修饰后，使来自病人的T细胞表达能特异识别肿瘤细胞表面抗原-HLA复合物的T细胞受体，从而成为肿瘤特异性杀伤细胞。目前，TCRT已经表明能使一些黑色素瘤、结肠直肠癌和滑膜肉瘤患者的肿瘤减小。但是克隆与患者的免疫类型相匹配、与肿瘤细胞表面抗原高亲和力结合的TCR难度大。CART是分离肿瘤患者T细胞，通过基因工程嵌入特定的抗原受体（CAR），使得T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性增强，并且对肿瘤细胞表面抗原的识别不依赖MHC的限制性。CARs由胞外抗原结合区、跨膜区、以及胞内的T细胞受体的信号转导区（如 CD3ζ和 CD28）组成。胞外抗原结合区由单克隆抗体的轻链（VL）和重链（VH）组成，中间由铰链连接形成单链抗体（single chain fragment variable，scFv），能够识别特定的肿瘤抗原。有相关临床试验表明，CAR在其它治疗方法无效的淋巴癌患者身上具有较好的治疗效果。美国宾夕法尼亚大学Carl June进行的CART-19研究表明75名白血病患者（包括成人和儿童患者），有45人经过CART细胞治疗之后病情完全缓解（complete remission）。除了CART会导致细胞因子风暴等副作用外，还存在3大问题：首先，对于一些因淋巴细胞数量较低或质量较差的晚期患者失去CART治疗的机会；其次，CART疗法在实体瘤中的疗效仍不显著，可能因为免疫抑制检验点信号通路的影响，导致免疫细胞在肿瘤组织内的存活率较差、活性不高；最后，由于CART是个体化治疗，成本昂贵，增加了病人负担。因此开发同种异体来源的通用CAR-T细胞能够推广其应用。Cellectis 公司通过TALEN 技术开发的异体 CAR-T 疗法 UCART19 定向敲除 TCR-α 基因（降低 GVHD）和CD52 基因（使细胞对alemtuzumab 耐药）已经成功治愈了一例复发性急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿。但是Cellectis通过TALEN敲除TCR需要繁琐的构建过程和大规模测序，并且脱靶率高。当前，规律成簇间隔短回文重复系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat；CRISPR-associated，CRISPR-Cas9）通过识别特定的DNA序列实现对基因的编辑，并且比TALEN更简单、高效。免疫检验点疗法是一类通过调节T细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。T细胞的激活需要双信号：一是MHC-多肽的信号；另一个是共刺激分子信号，主要有正向共刺激CD28、CD137等通路，以及调节T细胞不被过度刺激的负向共刺激CTLA4、PD1/PDL1通路。在共刺激信号激活之后，T细胞获得了有效的功能，可以到达肿瘤附近发挥杀伤作用。激活后的T细胞如何进入肿瘤微环境中又是一项难题。即使T细胞成功进入了微环境，还需要克服物理屏障，表皮细胞的阻挡，调节性T细胞的抑制作用，抑制性细胞因子等来发挥功能。其中T细胞负向共刺激分子的抑制性通路会被肿瘤利用来对抗免疫系统，使其逃脱机体免疫系统的监控和攻击。美国FDA批准了3种免疫检验点疗法药物，特异性结合T细胞表面CTLA-4受体的抗体类药物ipilimumab（Yervoy）以及特异性结合T细胞表面PD-1受体的抗体类药物pembrolizumab（Keytruda）和Opdivo（nivolumab）。2011年批准ipilimumab（Yervoy）用于治疗晚期黑色素瘤；2014年批准pembrolizumab（Keytruda）用于治疗对其它不再反应的晚期或不可切除黑色素瘤、Opdivo（nivolumab）用于治疗不再对其它药物响应的不可切除或转移性黑色素瘤患者；2015 年批准用于Opdivo（nivolumab）治疗以铂类为基础化疗或化疗后疾病进展的晚期（转移性）非小细胞肺癌患者。相关临床试验显示，PD1/PDL1单抗比CTLA4单抗有更强的抗肿瘤作用。但是免疫检验点单抗会导致T细胞的过度激活和扩增等有关不良反应，一些患者的器官本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR‑/PD‑1‑双阴性T细胞的sgRNA，其特征在于：靶向人TCR‑α基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO：1~15中的任意一种，靶向人PD‑1基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO：16~33中的任意一种。
【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的sgRNA，其特征在于：靶向人TCR-α基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO：1~15中的任意一种，靶向人PD-1基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO：16~33中的任意一种。2.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的sgRNA，其特征在于：靶向人TCR-α基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO：1~4中的任意一种，靶向人PD-1基因的sgRNA序列选自SEQ ID NO：16~19中的任意一种。3.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的sgRNA，其特征在于：靶向人TCR-α基因的sgRNA序列的反向互补DNA为SEQ ID NO：34~48中的任意一种，靶向人PD-1基因的sgRNA序列的反向互补DNA为SEQ ID NO：49~66中的任意一种。4.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的sgRNA，其特征在于：靶向人TCR-α基因的sgRNA序列的反向互补DNA为SEQ ID NO：34~37中的任意一种，靶向人PD-1基因的sgRNA序列的反向互补DNA为SEQ ID NO：49~52中的任意一种。5.一种基于CRISPR/Cas9系统构建TCR-/PD-1-双阴性T细胞的DNA寡核苷酸，其特征在于：靶向人TCR-α基因的sgRNA所对应的DNA寡核苷酸选自由SEQ ID NO：67和68互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO：69和70互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO：71和72互补配对形成的双链DNA寡核苷酸、由SEQ ID NO：73和74互补配对形成的双链DNA寡核苷酸中的任意一种；靶向人PD-1基因的sgRNA所对应的DN...
【专利技术属性】
技术研发人员：周超，安鸿，卢有德，周玲，巫春红，彭涛，尹海滨，
申请(专利权)人：广东华南联合疫苗开发院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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