一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3三个基因中任一个基因位于启动子1下游；另外两个基因之间通过2A序列连接位于启动子2下游；2个启动子启动表达的方向相反。脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法为将前文所述的载体转染相应的宿主细胞，培养后可获得病毒样颗粒或者重组杆状病毒，若获得的是重组杆状病毒，再将该病毒感染宿主细胞，即可获得病毒样颗粒。本发明专利技术获得的脊髓灰质炎病毒样颗粒可以在体内分别诱导高效价的中和滴度，可作为防治脊髓灰质炎病毒感染相关疾病的疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法
本专利技术属于生物技术和生物医药领域；涉及一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法。
技术介绍
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒感染引起的以肢体麻痹为主的急性肠道传染病，主要影响五岁以下的儿童，脊髓灰质炎没有特效治疗方法，是全球性广泛传播的、危害极大的急性传染病，由于具有特异的病理变化，及脊髓前角灰白质细胞的损害，尤其在灰质区，故称脊髓灰质炎。临床特征为肌肉麻痹，特别是机体的弛缓性麻痹，多发生在5岁以下儿童，尤其是婴幼儿，故亦称小儿麻痹症(niafntelipaarylsis)，但其并非仅仅侵害幼儿，成年人中亦多有发生，主要是隐性感染，发生麻痹病例只占0.1%-1%。病毒侵犯脊髓前角运动神经元，造成弛缓性肌肉麻痹，病情轻重不一，轻者无瘫痪出现，严重者累及生命中枢而死亡。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）属于小RNA病毒科肠道病毒属，内含单股正链RNA基因，脊髓灰质炎病毒基因组RNA长约7.5kb。基因组分为四个部分：5’端非编码区、多聚蛋白编码区、3’端非编码区和3’端Poly(A)尾。其中多聚蛋白编码区编码产生一个多聚蛋白前体，分为P1、P2和P3区，其中P1区可经蛋白酶水解产生衣壳蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，P2和P3区则可水解产生蛋白酶、RNA复制酶及用于识别细胞、调节基因的其他蛋白。P3区水解产生的蛋白3C在多聚蛋白前体加工过程中完成绝大多数裂解功能，其前体3CD也有3C的活性。5个拷贝的VP1、VP2、VP3和VP4构成了五聚体，12个五聚体构成二十面体核壳，脊髓灰质炎病毒主要抗原位点位于结构蛋白VP1，VP2和VP3上。脊髓灰质炎病毒有三个血清型，即I型、II型、III型，各型之间无交叉免疫反应。脊髓灰质炎没有特效治疗方法，只能疫苗预防。目前有上市的有两种脊髓灰质炎疫苗，口服减毒活疫苗(OPV)和灭活疫苗(IPV)。在我国，脊髓灰质炎疫苗属于国家免疫规划，由于成本问题，还主要使用OPV疫苗，但是由于口服炎减毒活疫苗可能有相关麻痹型脊灰（VAPP）和疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(VDPV)的风险，VAPP年发生率为每100万发生0.14例，只要继续使用口服脊髓灰质炎疫苗，就不能根除脊灰，世界上很多国家使用巴斯德生产的IPV疫苗，但是IPV生产需要严格的实验条件，成本控制是很大问题，且IPV疫苗中可以检测到猿猴病毒SV40，可以使培养的细胞发生转化，并可导致动物产生肿瘤，因此需要开发新型的安全的脊髓灰质炎疫苗。病毒样颗粒(ViruseLikeParticles，VLPs)疫苗是近年来发展起来的一种新型亚单位疫苗,它是体外表达的病毒结构蛋白在特定的条件下自动装配成的在形态上类似于天然病毒的空心颗粒，内部无病毒核酸结构，没有感染性，具有病毒的天然空间构象，具有很强的免疫原性和生物学活性，因此在新型疫苗开发方面有巨大优势。目前已有人乙型肝炎病毒和人乳头瘤病毒的VLPs已经被成功研制成疫苗且已投放市场。早在1990年David和1989年Toyohiko、1992年Sandra分别成功获得了脊灰I型和III型VLPs，Toyohiko等还用纯化得到的III型VLPs免疫小鼠，能够诱导小鼠产生中和抗体。因此，针对脊髓灰质炎病毒样颗粒研究是发展脊髓灰质炎病毒疫苗的首选目标。由于形成该类病毒VLP需要多个蛋白参与，需要构建多顺反子载体才能满足该目的。目前构建多顺反子载体的策略主要包括：（1）多个载体共同转染细胞，是目的蛋白共表达。但该方法需要同时转染多个载体到一个细胞中，其转染效率低，载体之间互相干扰，蛋白表达不平衡。（2）构建多启动子(multiplepromotors)表达载体。通过把多个基因分别连接不同类型的启动子下，通过各个启动子进行控制表达。但是由于不同的启动子的启动效率的差异，也会造成蛋白表达不均衡，蛋白相互作用距离较远。同时各个启动子元件较大，如果使用多个启动子就会加重载体的负担，影响转染和表达效率。（3）利用IRES系统构建多顺反子表达载体。利用内核糖体进入位点（IRES）连接多个目的基因，构建融合蛋白表达载体，实现在一个载体上多个基因共表达。其原理是在翻译蛋白的过程中不依赖RNA帽子结构，能够独立的募集核糖体，进而翻译下游基因，各个蛋白独立表达。该系统存在以下缺陷：（1）IRES自身结构较大（约为0.5kb），其应用常受到载体容量的限制，同时会增加载体的负担，导致转染效率降低。（2）IRES介导的上下游基因表达不平衡，通常下游基因的表达量仅是上游的20%到50%。所以在构建多顺反子载体系统中，IRES并不是理想的连接元件。（4）利用剪切多肽连接目的基因。常用的连接肽有2A序列、LP4序列、IRES序列、NIa蛋白酶及其识别序列及可以被宿主细胞蛋白酶识别的连接序列等。在不同种类的病毒中，具有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列统称为2A样序列。例如：小核糖核酸病毒的2A序列、昆虫病毒的2A样序列；C型轮状病毒的2A样序列。猪捷申病毒(Porcineteschovirus,PTV，一种小核糖核酸病毒)2A是自剪切多肽的典型，与其他自剪切肽相比具有结构短，大小为22个氨基酸（GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP），剪切效率高，上下游基因表达平衡性好，使其成为构建多顺反子载体的理想工具之一。在真核生物体内翻译的过程中，折叠后的2A对核糖体肽基造成空间位阻，使Pro-tRNA氨基亲核进攻无法完成，从而无法形成2A-tRNA酯键，因此在第19个氨基酸和第20个氨基酸之间会发生剪切作用，释放出融合了2A多肽尾巴的上游蛋白，形成与2A的融合蛋白，同时核糖体能继续翻译下游蛋白，形成N端带有一个脯氨酸的完整下游蛋白。整个过程不需要任何蛋白酶参与，上下游基因表达平衡，剪切效率高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体。本专利技术的另一目的在于提供一种及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3三个基因中任一个基因位于启动子1下游；另外两个基因之间通过2A序列连接位于启动子2下游；2个启动子启动表达的方向相反；其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列。进一步的，上述一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP1基因位于启动子1下游，构成“启动子1-VP1”的结构；脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0和VP3基因通过2A序列连接位于启动子2下游，构成“启动子2-VP3-2A-VP0”的结构；上述2个启动子启动表达的方向相反；其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；所述2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，其特征在于：该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3三个基因中任一个基因位于启动子1下游；另外两个基因之间通过2A序列连接位于启动子2下游；2个启动子启动表达的方向相反；其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I 型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；所述2A序列为编码含有D‑x‑E‑x‑N‑P‑G‑P氨基酸序列的基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，其特征在于：该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3三个基因中任一个基因位于启动子1下游；另外两个基因之间通过2A序列连接位于启动子2下游；2个启动子启动表达的方向相反；其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列；若脊髓灰质炎病毒为I型，所述VP0、VP1、VP3的碱基序列分别如SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6所示；若脊髓灰质炎病毒为II型，所述VP0、VP1、VP3的碱基序列分别如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9所示；若脊髓灰质炎病毒为III型，所述VP0、VP1、VP3的碱基序列分别如SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12所示。2.一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体，其特征在于：该载体中含有以下结构的表达框：脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP1基因位于启动子1下游，构成“启动子1-VP1”的结构；脊髓灰质炎病毒结构蛋白VP0和VP3基因通过2A序列连接位于启动子2下游，构成“启动子2-VP3-2A-VP0”的结构；上述2个启动子启动表达的方向相反；其中，VP0、VP1、VP3的三个基因组成完整的脊髓灰质炎病毒结构蛋白P1基因；所述脊髓灰质炎病毒为脊髓灰质炎I型病毒、脊髓灰质炎II型病毒或脊髓灰质炎III型病毒；所述2A序列为编码含有D-x-E-x-N-P-G-P氨基酸序列的基因序列；若脊髓灰质炎病毒为I型，所述VP0、VP1、VP3的碱基序列分别如SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6所示；若脊髓灰质炎病毒为II型，所述VP0、VP1、VP3的碱基序列分别如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9所示；若脊髓灰质炎病毒为III型，所述VP0、VP1、VP3的碱基序列分别如SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12所示。3.权利要求1～2任一所述的一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）根据脊髓灰质炎病毒的P1基因序列，根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化，合成优化的P1基因序列；2）根据优化的P1基因序列，设计引物将VP0、VP1、VP3中任一个基因先克隆至骨架载体中，位于骨架载体的一个启动子的下游，再将另2个基因通过2A序列进行连接，并将连接好的片段克隆至同一骨架载体的另一个启动子...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭涛，许煜华，马书智，王弋，安鸿，尹海滨，
申请(专利权)人：广东华南联合疫苗开发院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44