一种慢病毒单质粒体内生物素化载体及制备方法技术

本发明专利技术属于蛋白表达纯化和干细胞技术研究领域，具体涉及一种慢病毒单质粒体内生物素化载体及制备方法。本发明专利技术所述慢病毒单质粒体内生物素化载体包含骨架载体pCDH‑MCS‑T2A‑PURO‑MSCV、FLAG标签、生物素化识别标签AVI、自我剪接肽P2A、HA标签和生物素连接酶BirA基因序列。本发明专利技术的体内生物素化载体用于制备生物素化目的蛋白，后续通过链亲和素—生物素亲和纯化研究蛋白——蛋白相互作用或蛋白——核酸相互作用，与传统的免疫沉淀实验方法相比，具有更高的特异性和更强的亲和力，能够获得更加精确的实验结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白表达纯化和干细胞技术研究领域，具体涉及一种慢病毒单质粒体内生物素化载体及制备方法。
技术介绍
共免疫沉淀和染色质免疫沉淀是研究蛋白相互作用和蛋白质核酸相互作用最经典、最具说服力的实验。传统的共免疫沉淀方法原理是蛋白质(抗原)与其特异性抗体孵育，抗体在富集相应抗原的同时也富集与抗原蛋白分子相互作用的其他蛋白，之后通过免疫印迹或质谱分析相互作用的蛋白。传统的染色质免疫沉淀同样是利用抗原抗体相互作用的原理将抗原蛋白结合的核酸进行富集，再进行后续研究。这两种传统的免疫沉淀方法都依赖于抗原蛋白分子的特异性抗体。如果研究的蛋白没有相应的抗体，将会极大地阻碍研究的顺利进行；即使有相应的抗体，如果抗体特异性或亲和力不高，也可能产生假阳性或假阴性的实验结果。此外，传统的方法通常需要过夜进行抗原抗体孵育过程，周期长。链亲和素与生物素结合不仅特异性高，结合亲和力也比抗原抗体结合强约300倍，通过链亲和素与生物素化蛋白结合的方法进行免疫沉淀或染色质免疫沉淀一般只需要孵育2小时，具有明显的优势。建立一种真核细胞体内生物素化蛋白制备方法，是链亲和素介导的蛋白表达纯化和免疫沉淀等研究亟待解决的问题。体内生物素化即在目的蛋白N端或C端融合一小段生物素连接酶识别标签AVI(也称生物素受体肽)，大肠杆菌生物素连接酶BirA(也称生物素全酶合成酶)能够催化含有生物素连接酶识别标签的蛋白生物素化，生物素连接酶催化目的蛋白生物素修饰具有极高的特异性。在哺乳动物细胞中，转染包含AVI-目的基因融合蛋白和BirA基因表达载体产生可溶性目的蛋白和BirA蛋白，在一定的培养条件下，细胞中表达的目的蛋白几乎可被完全生物素化。目前已有一些商品化的哺乳动物细胞体内生物素化载体，但存在以下局限性：1、目的蛋白和BirA基因分别用两个载体表达，生物素修饰水平相对较低；2、启动子多为广泛表达的启动子，无表达特异性；3、载体骨架为普通质粒载体，难以获得稳定表达的生物素修饰蛋白。4、价格昂贵且使用受限制。售价从5000元到上万元不等，而且生产商将载体进行了线性化，限制了骨架质粒的扩增。因此，构建干细胞特异性表达的一元生物素化慢病毒载体在干细胞和相关领域的研究中具有重要意义和广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题提供一种慢病毒单质粒体内生物素化载体及制备方法。本专利技术为解决上述问题而采取的技术方案为：一种慢病毒单质粒体内生物素化载体，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。进一步地，本专利技术所述慢病毒单质粒体内生物素化载体包含骨架载体pCDH-MCS-T2A-PURO-MSCV、FLAG标签、生物素化识别标签AVI、自我剪接肽P2A、HA标签和生物素连接酶BirA基因序列。本专利技术所述的骨架载体pCDH-MCS-T2A-PURO-MSCV核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本专利技术所述的Flag标签和生物素化识别标签AVI融合成融合基因Flag-AVI，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。本专利技术所述的自我剪接肽P2A、HA标签和生物素连接酶BirA基因序列融合为P2A-HA-BirA，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。本专利技术一种慢病毒单质粒体内生物素化载体的制备方法，包括如下步骤：步骤一：设计5’引物FLAG-F-NheI和3’引物AVI-R-NheI，引物退火形成双链DNA获得FLAG-AVI融合基因；限制性内切酶NheI切割pCDH-MCS-T2A-PURO-MSCV质粒，去磷酸化处理，胶回收；T4DNA连接酶将胶回收的载体片段与FLAG-AVI融合基因过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；提取的质粒进行电泳鉴定和DNA测序验证，构建成中间载体pLV-FLAG-AVI-MSCV。步骤二：设计5’引物P2A-F-NotI和3’引物BirA-R-NotI，PCR扩增获得1.1kb长的P2A-HA-BirA基因片段，限制性内切酶NotI分别切割该片段并进行胶回收纯化；限制性内切酶NotI切割pLV-FLAG-AVI-MSCV质粒，去磷酸化处理，胶回收；T4DNA连接酶将胶回收的载体片段与P2A-HA-BirA片段过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；提取的质粒进行电泳鉴定和DNA测序验证，构建成目的载体pLV-FLAG-AVI-P2A-HA-BirA-MSCV。本专利技术所述步骤一中，引物为：5’引物FLAG-F-NheI：5’-CTAGCGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGATGGCCGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAAG-3’其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5；3’引物AVI-R-NheI：5’-CTAGCCTTCGTGCCACTCGATCTTCTGGGCCTCGAAGATGTCGTTCAGGCCGGCCATCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCATGGTGGCGCTAGG-3’其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6。本专利技术所述步骤二中，引物为：5’引物P2A-F-NotI：5’-ATCCGCGGCCGCTGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGAAGGATAACACCGTG-3’其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7；3’引物BirA-R-NotI：5’-ATCCGCGGCCGCTTTTTCTGCACTACGCA-3’其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8；本专利技术一种慢病毒单质粒体内生物素化载体的制备方法方法，所述步骤一中，引物退火方法为：两条引物分别稀释至100μM，各取1μL加入PCR管，加入48μLddH2O，置水浴锅中95℃加热10min，取出缓慢降温至室温，即可退火形成双链，直接使用或-20℃保存；所述步骤二中，PCR反应条件为：95℃，3min；95℃,30Sec,57℃,30Sec,72℃1min，25个循环；72℃，3min。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：1、本专利技术的体内生物素化质粒以慢病毒载体作为骨架，有利于获得稳定表达生物素化目的蛋白的原代细胞和细胞系的建立，而且由于慢病毒对哺乳动物细胞广泛的适用性，本专利技术的体内生物素化质粒可用于多种细胞。2、本专利技术通过基因克隆的方法将生物素识别标签序列、生物素连接酶基因BirA整合到同一个质粒上，且生物素识别标签序列、生物素连接酶基因BirA为同一启动子转录，翻译成蛋白后由自我剪接肽P2A介导加工成有功能的蛋白。此种结构，一方面保证目的蛋白和BirA表达水平的平衡；另一方面产生的目的蛋白和BirA蛋白在细胞内的空间距离近。能够提高目的蛋白生物素修饰水平。3、本专利技术的体内生物素化载体在生物素识别标签序列上游添加了Flag标签序列，在BirA基因上游添加了HA标签。可以利用商品化的Flag和HA进行免疫印迹或免疫荧光验证载体和目的基因表达。与使用目的基因抗体昂贵的价格和未知的特异性相比，具有高特异性、低成本的优势。4、本专利技术的体内生物素化载体目的基因和BirA转录使用MSCV启动子，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种慢病毒单质粒体内生物素化载体，其特征在于：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒单质粒体内生物素化载体，其特征在于：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种慢病毒单质粒体内生物素化载体，其特征在于：所述慢病毒单质粒体内生物素化载体包含骨架载体pCDH-MCS-T2A-PURO-MSCV、FLAG标签、生物素化识别标签AVI、自我剪接肽P2A、HA标签和生物素连接酶BirA基因序列。3.根据权利要求2所述的一种慢病毒单质粒体内生物素化载体，其特征在于：所述的骨架载体pCDH-MCS-T2A-PURO-MSCV核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。4.根据权利要求2所述的一种慢病毒单质粒体内生物素化载体，其特征在于：所述的Flag标签和生物素化识别标签AVI融合成融合基因Flag-AVI，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。5.根据权利要求2所述的一种慢病毒单质粒体内生物素化载体，其特征在于：所述的自我剪接肽P2A、HA标签和生物素连接酶BirA基因序列融合为P2A-HA-BirA，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。6.权利要求1-5中任意一项所述一种慢病毒单质粒体内生物素化载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：设计5’引物FLAG-F-NheI和3’引物AVI-R-NheI，引物退火形成双链DNA获得FLAG-AVI融合基因；限制性内切酶NheI切割pCDH-MCS-T2A-PURO-MSCV质粒，去磷酸化处理，胶回收；T4DNA连接酶将胶回收的载体片段与FLAG-AVI融合基因过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；提取的质粒进行电泳鉴定和DNA测序验证，构建成中间载体pLV-FLAG-AVI-MSCV。步骤二：设计5’引物P2A-F-NotI和3’引物BirA-R-NotI，PCR扩增获得1.1kb长的P2A-HA-BirA基因片段，限制性内切酶NotI分别切割该片段并进行胶回收纯化；限制性内切酶NotI切割pLV-FLAG-AVI-MSCV质粒，去磷酸化处理，胶回收；T4DNA连接酶将胶回收的载体片段与P2A-HA-BirA片段过夜连接；连接产...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴勇延，崔永萍，王斌全，高伟，温树信，张春明，赵沁丽，刘青青，陈波，赵均，
申请(专利权)人：山西医科大学第一医院，
类型：发明
国别省市：山西;14