一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于基因工程的骨干质粒载体，所述骨干质粒载体包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框位于同一双元载体中，crRNA表达框由水稻U3启动子，壮观霉素抗性基因和Poly‑T终止子依次构成；LbCpf1核酸酶表达框由ZmUBI启动子，水稻偏好密码子改造后的LbCpf1编码序列和35s终止子依次构成。本发明专利技术还提供了利用所述质粒载体构建的含有靶标序列的重组载体，及其在水稻基因打靶中的应用。本发明专利技术的骨干质粒载体能够用于进行有效地目标片段的基因打靶，获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的水稻植株。

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种用于植物基因打靶的基因工程载体及在水稻基因改造中的应用。
技术介绍
水稻是世界上最主要的作物之一。水稻的产量和品质与国民经济及生活密切相关，持续不断的培育具有更加优良农艺性状的品种对于水稻生产至关重要。与传统育种方法相比，随着生物技术的不断发展，近些年逐渐成熟的基因打靶技术为水稻产量和品质等关键性状的优化提供了便捷和高效的手段。传统的基因打靶方法包括同源重组技术、锌指核酸酶技术(ZFN)、类转录因子激活物技术(TALEN)和CRISPR/Cas9技术，其中同源重组技术在植物中打靶效率极低，而ZFN和TALEN技术都存在基因工程载体构建复杂，周期长，成本高，不适于瞬时转化等技术问题，极大的限制了基因打靶技术在水稻育种改良过程中的实用性。而CRISPR/Cas9技术由于其在靶位点选择上具有一定的局限性，并且其剪切后修复易形成单碱基的缺失或插入，在一定程度上影响了突变体的获得。近2年发展出的CRISPR/Cpf1技术为基因打靶提供了新手段。CRSIPR/Cpf1系统是存在于细菌中的一种先天性免疫系统。Cpf1能够独自地对crRNA前体进行加工，然后利用成熟的crRNA特异性的识别和剪切DNA。利用这一原理，在真核生物细胞中，通过人工合成带有与Cpf1结合和特异识别靶位点的crRNA，同样可以引导Cpf1切割基因组中的靶点序列，在细胞启动DNA修复机制后，切割位点会出现随机的碱基插入或缺失，从而实现了位点特异性的基因打靶。目前，在大鼠中已成功实现了基因组的CRISPR/Cpf1定向基因打靶。在植物中还没有利用CRISPR/Cpf1系统实现基因打靶的报道。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于水稻基因打靶的基因工程骨干载体。具体而言，一方面，本专利技术提供了一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，所述crRNA表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1746至7878位所示。优选地，在所述骨干质粒载体中，a、所述crRNA表达框包括：水稻U3启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至487位所示；壮观霉素抗性基因(SpR)，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第495至1701位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1709至1716位所示，b、所述Cpf1核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1746至3777位所示；水稻偏好密码子改造后的Cpf1编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第3786至7607位所示和35s终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第7614至7878位所示。优选地，所述骨干质粒载体还包括：c、T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第10127至10150位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至25位所示，所述crRNA表达框和所述Cpf1表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。另一方面，本专利技术提供一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，文中称为pHUN611。另一方面，本专利技术提供一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有以下5’TTTN-(N)X-3’结构，(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1,N2……Nx}，N1,N2……Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，TTTN中的N也代表碱基A、G、C、T中的任意一个(优选地，X为25)；将所述靶标片段整合到上述的骨干质粒载体中，形成带有所述标靶片段的crRNA。优选地，所述载体构建包括，按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-GGCA-(N)X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAA-(N’)X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中正向寡核苷酸链中的(N)X和反向寡核苷酸中的(N’)X具有反向互补特征；用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，将所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过卡那霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于水稻目的基因打靶的重组载体。另一方面，本专利技术提供一种上述重组载体在水稻基因打靶中的应用，其特征在于，包括步骤如下，将所述重组载体转入水稻细胞，使所述水稻细胞同时含有针对靶标基因的crRNA和Cpf1核酸酶；在crRNA和Cpf1核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的双链靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。优选地，所述转入水稻细胞是指将所述重组载体经原生质体瞬时转化或农杆菌介导稳定转化到水稻细胞或组织中。优选地，所述应用用于获得在靶标片段上具有随机插入和/或随机缺失的水稻植株。另一方面，本专利技术提供一种获得宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求6所述的重组载体导入目标菌落。本专利技术所述的基因工程骨干载体是包含T-DNA边界序列的双元载体，在T-DNA左右两个边界内，包含2个表达框：Cpf1基因表达框和crRNA表达框，还可以包括潮霉素抗性基因表达框。在T-DNA边界外的载体骨架序列中，可以包含卡那霉素抗性基因等结构(图1)。在本专利技术中，SpR基因两端分别存在反向排列的BsaI内切酶识别位点(剪切位点如SeqIDNo.1第495位和1701位所示)，用于插入靶标片段。本专利技术还提供包含携带所述重组载体的转化子，其中，所用宿主为微生物，具体的为大肠杆菌和农杆菌。本专利技术的一个目的是应用所述重组载体，实现目的基因靶标片段的随机插入和/或随机缺失。具体而言，是通过重组载体转入水稻细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的crRNA和Cpf1核酸酶；在crRNA和Cpf1核酸酶的共同作用下，目的基因的双链靶标片段被剪切，诱导水稻细胞自身的DNA修复功能，最终实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。所述应用中，crRNA由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和与cpf1结合的骨架片段连接而成。所述crRNA中能与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’TTTN-(N)X-3’中(N)X互补结合的RNA片段。所述Cpf1核酸酶由SEQIDNo.1中第3786至7607位核苷酸所示DNA转录的RNA片段翻译而成的蛋白质。所述重组载体转入水稻细胞的方法为：向植物细胞直接导入重组载体的DNA序列，具体如PEG介导的原生质体瞬时转化或农杆菌介导的愈伤组织稳定转化。所述再生植株，由转化的水稻细胞或组织，如原生质体或愈伤组织分化再生而来。所述应用可获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的水稻植株。为了实现CRISPR/Cpf1系统在水稻基因组中的打靶，在本专利技术中，采用了水稻U3启动子表达crRNA和ZmUBI启动子驱动水稻偏好密码子化改造的Cpf1基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，所述crRNA表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至7878位所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，所述crRNA表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1746至7878位所示。2.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，a、所述crRNA表达框包括：水稻U3启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至487位所示；壮观霉素抗性基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第495至1701位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1709至1716位所示，b、所述Cpf1核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1746至3777位所示；LbCpf1编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第3786至7607位所示和35s终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第7614至7878位所示。3.根据权利要求2所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括：c、T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第10127至10150位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至25位所示，所述crRNA表达框和所述Cpf1表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。4.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括潮霉素抗性基因表达框。5.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。6.一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦瑞英，杨剑波，许蓉芳，杨亚春，李娟，李浩，李莉，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34