一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于基因工程的骨干质粒载体，所述骨干质粒载体包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框位于同一双元载体中，crRNA表达框由水稻U3启动子，壮观霉素抗性基因和Poly‑T终止子依次构成；LbCpf1核酸酶表达框由ZmUBI启动子，水稻偏好密码子改造后的LbCpf1编码序列和35s终止子依次构成。本发明专利技术还提供了利用所述质粒载体构建的含有靶标序列的重组载体，及其在水稻基因打靶中的应用。本发明专利技术的骨干质粒载体能够用于进行有效地目标片段的基因打靶，获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的水稻植株。

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因工程的骨干质粒载体及应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种用于植物基因打靶的基因工程载体及在水稻基因改造中的应用。
技术介绍
水稻是世界上最主要的作物之一。水稻的产量和品质与国民经济及生活密切相关，持续不断的培育具有更加优良农艺性状的品种对于水稻生产至关重要。与传统育种方法相比，随着生物技术的不断发展，近些年逐渐成熟的基因打靶技术为水稻产量和品质等关键性状的优化提供了便捷和高效的手段。传统的基因打靶方法包括同源重组技术、锌指核酸酶技术(ZFN)、类转录因子激活物技术(TALEN)和CRISPR/Cas9技术，其中同源重组技术在植物中打靶效率极低，而ZFN和TALEN技术都存在基因工程载体构建复杂，周期长，成本高，不适于瞬时转化等技术问题，极大的限制了基因打靶技术在水稻育种改良过程中的实用性。而CRISPR/Cas9技术由于其在靶位点选择上具有一定的局限性，并且其剪切后修复易形成单碱基的缺失或插入，在一定程度上影响了突变体的获得。近2年发展出的CRISPR/Cpf1技术为基因打靶提供了新手段。CRSIPR/Cpf1系统是存在于细菌中的一种先天性免疫系统。Cpf1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，所述crRNA表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1746至7878位所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，包含crRNA表达框和Cpf1核酸酶表达框，所述crRNA表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至1716位所示，所述Cpf1核酸酶表达框的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1746至7878位所示。2.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，a、所述crRNA表达框包括：水稻U3启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第107至487位所示；壮观霉素抗性基因，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第495至1701位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1709至1716位所示，b、所述Cpf1核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第1746至3777位所示；LbCpf1编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第3786至7607位所示和35s终止子，其核苷酸序列如SeqIDNo.1第7614至7878位所示。3.根据权利要求2所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括：c、T-DNA的左、右边界序列，其中，所述左边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第10127至10150位所示，所述右边界序列的核苷酸序列如SeqIDNo.1第1至25位所示，所述crRNA表达框和所述Cpf1表达框位于所述左边界序列和所述右边界序列之间。4.根据权利要求1所述的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体还包括潮霉素抗性基因表达框。5.一种用于基因工程的骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。6.一种用于水稻目的基因打靶的重组载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦瑞英，杨剑波，许蓉芳，杨亚春，李娟，李浩，李莉，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34