一种基因工程热稳定疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种制备热稳定疫苗的方法，特别涉及一种联合使用基因工程和仿生矿化技术制备热稳定疫苗的方法。本发明专利技术提供一种利用基因工程技术在疫苗表面引入具有诱导无机物矿化能力的多肽的方法；(1)构建疫苗的基因克隆；(2)将多肽的核酸序列插入疫苗基因克隆中，得到重组克隆；(3)将重组克隆在细胞或大肠杆菌内表达，得到具有自矿化能力的疫苗。本发明专利技术还一种制备钙矿化上述制得的具有自矿化能力的疫苗的方法；(1)向有酸根的疫苗液加入Ca2+离子；(2)将体系进行孵育，获得磷酸钙包被疫苗。本发明专利技术通过疫苗矿化，高效地解决了疫苗运输和保存中的热失活现象，显著降低疫苗的财政支出，在新型热稳定疫苗生产中有很好的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种基因工程热稳定疫苗及其制备方法
本专利技术涉及生物技术，具体涉及一种基因工程热稳定疫苗及其制备方法，特别涉及一种具有自矿化能力的疫苗及其制备方法，以及矿化该疫苗的方法。
技术介绍
传染性疾病对公共卫生安全造成严重的威胁，每年导致上百万人的死亡。疫苗接种作为对抗传染病最有效的医疗手段，挽救了无数人的生命。特别地，减毒活疫苗(即病毒的减毒毒株)成为最为重要的一种疫苗形式，在天花和脊髓灰质炎的消灭过程中发挥了巨大作用。目前仍在临床使用的减毒活疫苗包括脊髓灰质炎疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、流感疫苗、黄热疫苗、风疹疫苗、轮状病毒疫苗、甲型肝炎疫苗以及腺病毒疫苗等。由于疫苗为典型的生物制品，具有温度敏感性，因此运输和保藏过程必须采用低温环境(如冷冻)。据统计，由于储藏或运输不当，每年约有50%的疫苗被浪费。尤其在缺乏可靠冷链基础设施的发展中国家和贫困地区，疫苗的低温保存仍然非常困难。疫苗的冷链花费占据了大部分财政支出，每年超出2亿美元。尤其在发展中国家，冷链花费占全国疫苗总财政支出的80%以上。因此，改善疫苗的热稳定性，制备热稳定的疫苗具有重大价值。现有的改善活疫苗稳定性的方法如下：(1)在液体或干粉状态的疫苗中添加稳定剂，如重水、MgCl2和非还原性糖；(2)在疫苗的冻干技术中，采用糖玻璃化干燥、喷雾干燥等，以增强疫苗的稳定性；(3)借助蛋白质工程技术，通过增加亚单位之间的静电作用力，衣壳-核酸的相互作用或者引入二硫键的方式等来增加疫苗粒子的热稳定性。(4)在液体状态，利用矿化技术直接在疫苗表面形成磷酸钙矿化外壳的策略。以上策略在制定热稳定疫苗应用上存在一些限制，例如方法(1)(2)(3)一般需要复杂的处理过程、方法(3)尚不能产生良好的保护效果、方法(4)直接矿化的策略需要疫苗表面存在大量的对钙离子高吸附性的基团，例如包膜病毒脂双层的磷脂分子，因此这一方法只能应用于某些特定包膜病毒疫苗，而且该矿化需要高浓度的钙离子，可能对生物体或疫苗产生毒性。利用仿生矿化在疫苗表面引入无机物外壳来提高疫苗的热稳定性是一种新型的、具有良好应用前景的策略。为了提高该策略在制备热稳定疫苗领域的广泛应用性、实行方便性，本专利技术提出一种通过基因工程技术或化学修饰技术在疫苗表面引入具有诱导无机物矿化能力的多肽，来实现疫苗自矿化的策略。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有自矿化(self-biomineralization)能力的疫苗；这种具有自矿化能力疫苗的制备方法，以及该疫苗的钙矿化方法。本专利技术制备的钙矿化疫苗是一种具有核-壳结构的热稳定疫苗。按照本专利技术的方法制得的疫苗具有良好的热稳定性，疫苗可以在25℃～37℃储存一周以上仍保持良好的疫苗活性，甚至在超过37℃的高温也能保持数天良好的疫苗活性。本专利技术提供了一种新型的、通过联合使用基因工程和仿生矿化技术制备热稳定性疫苗的方法，本专利技术首先通过基因工程技术制得具有自矿化能力的疫苗，所述疫苗的表面包含多肽，所述的多肽具有诱导无机物矿化的能力；然后利用更为温和的仿生矿化手段制得具有热稳定性的矿化疫苗，所述的矿化疫苗是具有核-壳结构的热稳定疫苗，其表面带有无机物外壳，疫苗以及多肽被无机物外壳所包被(coated)，无机物外壳对疫苗有保护作用，使疫苗能在常温或高温环境下保持活性。本专利技术的方法具有良好的生物相容性。由于本专利技术在疫苗表面引入了具有诱导无机物矿化能力的多肽，使得疫苗的矿化能力不再依赖于疫苗本身的性质，突破了利用矿化方法制备热稳定性疫苗的技术障碍，打破了疫苗本身矿化能力的限制，可以适用于几乎所有的疫苗，大大拓宽了可矿化疫苗的范围，促进了利用矿化方法制备具有热稳定性疫苗的应用，从而使疫苗的保存在很大程度上摆脱了对冷链的依赖，具有非常好的经济效益和社会效益。本专利技术采用如下的技术方案：一种具有自矿化能力的疫苗，所述疫苗的表面包含多肽，所述的多肽具有诱导无机物矿化的能力，并且所述的多肽通过基因工程技术或化学修饰的方法引入。所述的基因工程技术，又称基因拼接技术、DNA重组技术，是指以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。例如，可以通过融合PCR技术或DNA重组技术将多肽的编码核酸序列导入疫苗的核酸序列中。所述的化学修饰是指是用吸附、层层自组装、聚合、化学反应等方法将多肽引入疫苗中。本专利技术所述的疫苗的自矿化能力是指疫苗具备了良好的矿化能力，能够在较宽泛的无机离子浓度范围下实现矿化，即疫苗仅需孵育（incubation）在较宽浓度的无机离子的溶液中，即可从周围溶液中富集无机离子到其表面，产生无机矿物相局部过饱和，进而发生无机物在疫苗上的沉积矿化(如图1所示)。所述的自矿化能力是由于在疫苗表面引入了（incorporated）具有诱导无机物矿化能力的多肽而产生的，多肽的引入导致疫苗矿化对无机离子浓度的依赖性降低，使疫苗可以在较低的无机离子浓度实现矿化，从而避免了高浓度的无机离子对生物体或疫苗产生毒性。本专利技术提供的自矿化疫苗是一种基因工程疫苗，是利用基因工程技术将具有诱导无机物矿化能力的多肽引入到疫苗基因组克隆中而获得。所述诱导无机物矿化能力是指疫苗表面引入的多肽具有较强的螯合、吸附无机物离子的能力，可以促使疫苗从溶液中富集无机物离子，导致无机物在疫苗表面的沉积矿化，在疫苗表面形成包被疫苗的无机物外壳，从而实现疫苗的矿化。作为优选，所述的无机物可以是含钙矿物，所述的含钙矿物是指其主要的阳离子成分是Ca2+离子的矿物(mineral)，所述的含钙矿物可选自磷酸钙、碳酸钙、草酸钙中的任意一种或任意多种。所述的无机物可以通过在疫苗溶液中加入Ca2+离子（例如，加入可溶性钙盐）和酸根离子（所述的酸根离子选自磷酸根离子、碳酸根离子、草酸根离子的任意一种或任意多种，例如，可加入含有上述酸根离子的可溶性盐）形成矿物而获得。作为优选，本专利技术中涉及的疫苗自矿化能力是指疫苗在宽泛的Ca2+离子浓度下容易实现矿化，获得磷酸钙矿化疫苗。所述的Ca2+离子浓度可以是较低的浓度，例如Ca2+离子浓度为4mM以上，优选的Ca2+离子浓度为5.5～20mM，更优选的Ca2+离子浓度为5.5～6.5mM。所述的Ca2+离子浓度可以是较高的浓度，以疫苗不失活而且矿化疫苗中的无机物不对生物体产生明显毒害为界。为了赋予疫苗自矿化能力，在疫苗表面通过基因工程或化学修饰的方法引入多肽，所述的多肽具有较强的吸附无机离子能力，促使疫苗从周围溶液中富集无机离子，导致疫苗表面无机矿物相过饱和，从而使疫苗具有自矿化能力，容易通过矿化的方法在疫苗表面形成无机物外壳。当所述的无机物为含钙矿物，疫苗表面引入的多肽为含有羧基的多肽，多肽上的羧基可以从周围溶液中富集Ca2+离子，导致疫苗表面的钙矿物相过饱和，使疫苗具有自矿化能力，容易通过矿化的方法在疫苗表面形成含钙矿物外壳。作为优选，所述含有羧基的多肽为含有天冬氨酸(Asp)和/或谷氨酸(Glu)的多肽；更优选的，所述的含有羧基的多肽为富含天冬氨酸(Asp)和/或谷氨酸(Glu)的多肽，所述的多肽中，天冬氨酸或者谷氨酸或者天冬氨酸和谷氨酸的组合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有自矿化能力的疫苗，其特征在于：所述疫苗的表面包含多肽，所述的多肽具有诱导无机物矿化的能力，并且所述的多肽通过基因工程手段或化学修饰的方法引入。

【技术特征摘要】
2013.04.10 CN 201310123706.21.一种具有自矿化能力的疫苗，其特征在于：所述疫苗的表面包含多肽，所述的多肽具有诱导无机物矿化的能力，并且所述的多肽通过基因工程手段的方法引入，所述的无机物为含钙矿物，所述的多肽为含有羧基的多肽。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述的含钙矿物选自磷酸钙、碳酸钙、草酸钙中的任意一种或任意多种。3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述的含有羧基的多肽为含有天冬氨酸和/或谷氨酸的多肽。4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述的多肽包含如下所示序列其中之一：X-X-Lys(X)-X-X-Pro-X-Ser-Gln-Arg-Arg-Ile-Gly-Arg-Phe-Gly；X-X-Ser-Ser-X-X-Lys-Phe-Leu-Gly-Arg-Phe-Gly；X-X-Ser-Ser-(X-X)n；Pro-(Phe-X)n-Pro；其中X为Asp或Glu，n为1-6。5.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗为单价疫苗或多价疫苗。6.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗为病毒疫苗。7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述的病毒疫苗选自脊髓灰质炎疫苗、肠道病毒疫苗、腺病毒疫苗、乙型脑炎疫苗、水痘疫苗、轮状病毒疫苗、甲型肝炎疫苗、黄热疫苗、流感疫苗、风疹疫苗、艾滋病疫苗。8.一种疫苗组合物，其特征在于：所述的疫苗组合物包含权利要求1-7任一项所述的具有自矿化能力的疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分。9.权利要求1-7任一项所述的具有自矿化能力疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)构建疫苗的基因组克隆，得到疫苗核酸序列；(2)将编码多肽的核酸序列插入步骤(1)获得的疫苗核酸序列的目的位置，得到疫苗的重组克隆；(3)将步骤(2)得到疫苗的重组克隆在细胞内表达，得到具有自矿化能力的疫苗。10.一种疫苗组合物，其特征在于：所述的疫苗组合物包含权利要求9所述的方法制得的具有自矿化能力的疫苗，以及提高疫苗稳定性或免疫原性的成分。11.一种具有热稳定性的矿化疫苗，其特征在于：所述的矿化疫苗包...

【专利技术属性】
技术研发人员：王广川，秦成峰，唐睿康，李晓峰，徐旭荣，秦鄂德，
申请(专利权)人：浙江大学，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33