本发明专利技术公开了一种鸭疫里默氏杆菌血清１型基因工程减毒菌株及其构建方法，该方法是将自杀性质粒ｐＤＳ－１３２与鸭疫里默氏杆菌血清１型基因ΔＡｃＯＡＴ分别进行Ｓａｌ Ⅰ单酶切胶回收后，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，得到ｐＤＳ１３２：：ΔＡｃＯＡＴ自杀性质粒；然后通过电转化方法将ｐＤＳ－１３２：：ΔＡｃＯＡＴ转入鸭疫里默氏杆菌血清１型ＧＤＧＺ菌株感受态细胞，氯霉素抗性平板筛选重组突变菌株即为鸭疫里默氏杆菌血清１型基因工程减毒菌株。经动物试验证明以１０倍ＬＤ５０剂量攻毒试验表明该减毒菌株毒力已明显下降，以基本无毒力，且该减毒菌株不会无毒力返强，具有制备弱毒活疫苗的潜力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鸭疫里默氏杆菌血清1型N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶 (N-acetylornithine aminotransferase，AcOAT)基因的核苷酸序列，同时还涉及利 用该基因构建的。
技术介绍
鸭疫里默氏杆菌0 /emwe〃a朋加》e幼;/^, iL4)病是鸭、鹅、火鸡和其它 鸟类的一种高致病性、接触性传染病，该病主要侵害1 8周龄(尤其2 3 周龄)雏鸭、雏鹅及雏火鸡。鸭疫里默氏杆菌病呈急性或慢性败血症过程，主 要以神经症状和纤维素性心包炎，肝周炎和气囊炎为特征。该病的发病率可达 90%以上，致死率可高达75%以上，耐过病鸭常常长成残次鸭或僵鸭，饲料转 化率降低，生长发育迟缓。此外，由该病所引起的输卵管炎也是影响鸭成年后 产蛋率低下的最重要原因之一。该病在世界范围内广泛流行，是目前造成养鸭 业经济损失的最主要和最为严重的传染病之一。给养鸭业造成了巨大的经济损 失。药物预防是我国目前控制该病的一项主要措施之一。但是目前对临床分离 菌株的大量药敏试验表明RA己对兽医临床上使用的大多数抗菌药物均产生 了耐药性，生产实际中的防治效果并不理想，而要达到比较好的防治效果，必 须反复投药，这既增加了生产成本，又易产生耐药性。因此，药物防治该病存 在很大的局限性。因而免疫接种则成为控制该病的更为有效的措施。但是，随 着越来越多新血清型的出现，且各血清型之间缺乏交叉保护，这也给免疫预防 带来了极大的困难。我国目前生产上应用较广的RA灭活疫苗的实际免疫保护 效果并不理想、存在着免疫水平较低、免疫持续时间较短，需进行多次接种、 血清型保护谱较窄、不能产生交叉保护等诸多缺点。因此，对RA新型候选疫 苗的研究和开发己经成为RA防治的关键。基因敲除(gene knockout)是在80年代后半期应用DNA同源重组原理发展 起来的一门新技术。基因敲除是指对一个已知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其它基因取代，然后对敲除后的个体进行研究，通过其性 状的变化而研究被敲除基因的功能。该技术已广泛应用于细菌突变株的构建， 但在鸭疫里默氏杆菌中，目前还未见公开报道。N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶(N-acetylornithine aminotransferase, AcOAT)是精氨酸生物合成代谢的关键酶之一。在存在L-谷氨酸时，它催化N-乙酰谷氨 酸半醛向N-乙酰鸟氨酸的转换。在大肠杆菌中，N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶也 参与赖氨酸的生物合成。在许多微生物中，L-精氨酸是其碳和氮的来源。而在 一些包内寄生致病菌中，L-精氨酸的转运和代谢是它们在胞内生存的必需条 件。Gordhan等(2002年)构建了结核分枝杆菌鸟氨酸氨甲酰转移酶基因缺失 的突变株，结果表明突变株对免疫缺陷的SCID鼠毒力下降，而对免疫功能完 整的DBA/2鼠则毒力明显下降。Namiki等(2001年)运用限制性内切酶介导 的整合突变技术(REMI)筛选尖孢镰刀菌的致病因子，获得了 13株致病力减 弱的突变株，分析表明其中一突变株突变的基因可能编码参与精氨酸生物合成 代谢的精氨基琥珀酸裂解酶基因。Klarsfeld等于1994年报道了编码精氨酸 ABC转运载体转座插入突变的李斯特单核杆菌，结果显示突变体的LDso要比 野生型高两倍。而在RA中N-乙酰鸟氨酸氨基转移酶基因及其与RA毒力之 间相关性目前在国内外均未见报道。
技术实现思路
为了解决上述现有技术的不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种鸭疫 里默氏杆菌血清1型(RA1)基因工程减毒菌株，该菌株使N-乙酰鸟氨酸氨 基转移酶基因产生缺失突变，使鸭疫里默氏杆菌毒力下降。本专利技术的鸭疫里默 氏杆菌血清1型基因工程减毒菌株可用于鸭疫里默氏杆菌基因工程活疫苗的 研制。本专利技术的另一目的在于提供上述鸭疫里默氏杆菌血清1型基因工程减毒 菌株的构建方法。本专利技术所使用的自杀性质粒pDS132，带有氯霉素抗性基因、^cS基因， i W复制起始位点和i /^基因、并切除了 insert序列，具有如下特点(1)氯 霉素抗性基因用于筛选质粒转导成功的菌株；(2) i 6《复制起始位点是依赖于 兀蛋白的起始位点，兀蛋白是由pir基因所编码，因此自杀质粒pDS132只能在 含有pir基因的菌株内复制，在不含pir基因的菌株内则会逐渐丢失。本专利技术 所使用的自杀载体宿主菌是SM10pir，它携带有pir基因，能够提供反式兀蛋 白，因此自杀性质粒pDS132可以在SM10pir中复制；(3)来源于枯草芽胞杆 菌(Bacillussub tills)的^c5基因编码果聚糖蔗糖酶，表达sac5基因的革兰氏阴 性菌在含5%蔗糖的培养基上不能生长，也就是说在含蔗糖的培养基中，带有 自杀性载体的菌株不能生长，只有丢失了质粒的菌株才能生长，这就提供了一 种筛选质粒丢失菌株的方法；(4) i P4能够诱导细菌接合(conjugation)而发生 质粒在细菌间直接转移。(5) insert序列的切除降低了随机重组生的发机率。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现 一种鸭疫里默氏杆菌血清1型基因 工程减毒菌株的构建方法，包括如下步骤(1) pDS132::AAcOAT自杀性质粒的构建将自杀性质粒pDS-132与鸭疫里默氏杆菌血清1型基因即AA04r分别 进行Sal I单酶切胶回收后，并将酶切的自杀性质粒pDS132用CIAP去磷酸 化，以T4DNA连接酶连接，得到pDS132::AAcOAT自杀性质粒；转化大肠 杆菌SM10pir，重组子用菌落PCR鉴定，阳性克隆提取质粒，用Sal I酶切后， 琼脂糖凝胶电泳鉴定。所述鸭疫里默氏杆菌血清1型基因AA:04r为左臂基因序列加右臂基因 序列，所述左臂基因序列由319个核苷酸组成，5'端至3'端序列为1 GCGGTAAATA AGTAACTATG CCAATTTTCG TTATTACCGT TACAATAAAA AATTAGACCT61 GTTTCMTTG CCTGATCATG CMCAAGATT TCTTTAAGTA TCAAGCTCAA ACCACACCTT121 TTGCCTCAGG TTTTGAAGCC GAAAGAGCAG AAGGAAACTA TATTTACGGA AAAGATGGCA181 AAGCCTATCT AGACTTTGTA GCAGGAGTAT CTGCCAATAC TTTGGGACAT TCGCACCCAA241 AAATCATCAA TGCAATTAAG GAACAGGCAG ATAMTACCT TCATATAAGG TCTATGGAGA301 GTATGCACAA GAGAAACCT。所述右臂基因序列由240个核苷酸组成，5'端至3'端序列为1 TAACATTAGG CGTATAAGTA AATATTTGGG CGTGCCCCAA GCCGAGGCTA TTCCCTAAGC 61 TGATGGGTCG GTCTTCGGGC AGTCGCTCTT TTTTAGCCGA AGCTCTCCAG TAGCTAAGCC 〗.21 CAGCTTTTCT CCACCTCCGA AAAAAAAGGA GCTCCAACAA TGCCCTCCGC CCTCACGCAG 181 TAAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭疫里默氏杆菌血清１型基因工程减毒菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤： （１）ｐＤＳ１３２∷ΔＡｃＯＡＴ自杀性质粒的构建 将自杀性质粒ｐＤＳ－１３２与鸭疫里默氏杆菌血清１型基因ΔＡｃＯＡＴ分别进行Ｓａｌ Ｉ单酶切胶回收后，并将酶切的自杀性质粒ｐＤＳ１３２用ＣＩＡＰ去磷酸化后，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，得到ｐＤＳ１３２∷ΔＡｃＯＡＴ自杀性质粒； 所述鸭疫里默氏杆菌血清１型基因ΔＡｃＯＡＴ由５５９个核苷酸组成，ΔＡｃＯＡＴ基因的核苷酸序列如下： １ ＧＣＧＧＴＡＡＡＴＡ ＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧ ＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧ ＴＴＡＴＴＡＣＣＧＴ ＴＡＣＡＡＴＡＡＡＡ ＡＡＴＴＡＧＡＣＣＴ ６１ ＧＴＴＴＣＡＡＴＴＧ ＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧ ＣＡＡＣＡＡＧＡＴＴ ＴＣＴＴＴＡＡＧＴＡ ＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡ ＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴ １２１ ＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧ ＴＴＴＴＧＡＡＧＣＣ ＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧ ＡＡＧＧＡＡＡＣＴＡ ＴＡＴＴＴＡＣＧＧＡ ＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡ １８１ ＡＡＧＣＣＴＡＴＣＴ ＡＧＡＣＴＴＴＧＴＡ ＧＣＡＧＧＡＧＴＡＴ ＣＴＧＣＣＡＡＴＡＣＴＴＴＧＧＧＡＣＡＴ ＴＣＧＣＡＣＣＣＡＡ ２４１ ＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡ ＴＧＣＡＡＴＴＡＡＧ ＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧ ＡＴＡＡＡＴＡＣＣＴ ＴＣＡＴＡＴＡＡＧＧ ＴＣＴＡＴＧＧＡＧＡ ３０１ ＧＴＡＴＧＣＡＣＡＡ ＧＡＧＡＡＡＣＣＴＴ ＡＡＣＡＴＴＡＧＧＣ ＧＴＡＴＡＡＧＴＡＡ ＡＴＡＴＴＴＧＧＧＣ ＧＴＧＣＣＣＣＡＡＧ ３６１ ＣＣＧＡＧＧＣＴＡＴ ＴＣＣＣＴＡＡＧＣＴ ＧＡＴＧＧＧＴＣＧＧ ＴＣＴＴＣＧＧＧＣＡ ＧＴＣＧＣＴＣＴＴＴ ＴＴＴＡＧＣＣＧＡＡ ４２１ ＧＣＴＣＴＣＣＡＧＴ ＡＧＣＴＡＡＧＣＣＣ ＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣ ＣＡＣＣＴＣＣＧＡＡ ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＧ ＣＴＣＣＡＡＣＡＡＴ ４８１ ＧＣＣＣＴＣＣＧＣＣ ＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴ ＡＡＡＧＣＴＣＴＡＡ ＡＡＡＴＣＡＴＡＡＧ ＡＴＴＴＧＧＴＣＴＴ ＴＡＡＧＡＴＴＴＧＣ ５４１ ＴＡＧＡＧＴＴＴＧＴ ＧＴＡＴＡＴＴＴＧ； （２）鸭疫里默氏杆菌血清１型基因工程减毒菌株的构建 将步骤（１）中构建的ｐＤＳ１３２∷ΔＡｃＯＡＴ自杀性质粒，通过电转化方法将ｐＤＳ－１３２∷ΔＡｃＯＡＴ转入鸭疫里默氏杆菌血清１型ＧＤＧＺ菌株感受态细胞，氯霉素抗性平板筛选重组突变菌株即为鸭疫里默氏杆菌血清１型基因工程减毒菌株。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡建平，袁建丰，覃宗华，吕敏娜，吴彩艳，余劲术，
申请(专利权)人：广东省农业科学院兽医研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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