抗霉浆菌的亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供抗霉浆菌的亚单位疫苗，特别是合适作为抗霉浆菌的亚单位疫苗的活性成分的蛋白质及以其制得的疫苗。所述蛋白质经实验证实可引发足够强度的免疫反应而避免猪只感染霉浆菌。所述疫苗可含有一种前述的蛋白质作为活性成分，或含有两种以上所述的蛋白质而形成鸡尾酒疫苗的形式。本发明专利技术的疫苗不仅较惯用疫苗更具安全性，同时具有相当、甚至是更优异的免疫效果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗霉浆菌的亚单位疫苗
本专利技术关于一种抗猪霉浆菌的疫苗，尤指一种抗猪霉浆菌的亚单位疫苗(SubunitVaccine)。
技术介绍
霉浆菌(Mycoplasmaspp.)是目前所知能在细胞外自行复制的最小细菌，其引发的猪霉浆菌肺炎虽然不会造成猪只的高死亡率，但会降低饲料换肉率、导致生长发育迟缓、造成发炎性反应及免疫抑制作用、及引起其它诸多细菌性病原的感染，因而使养猪业者蒙受严重的经济损失。目前对于猪霉浆菌肺炎的防治方式有三，包括：药物投予、饲养管理及疫苗接种。由于抗生素对于猪肺炎霉浆菌的预防效果不佳，因此药物投予的策略仅限于治疗目的，难以达到预防的效果。此外，考虑到药物滥用可能引发更大规模的抗药性菌种的感染，采用药物投予不仅需要更多的规划，同时面临诸多极限。良好的饲养管理是防治猪霉浆菌感染的根本方法。优良的猪舍环境卫生质量及妥善的饲养管理有助于减少感染的发生。从另一方面来说，配合疫苗接种更可使整体的防疫工作更加完善。领域中现行使用的疫苗是以不活化死菌作为疫苗的活性成分。然而，因为霉浆菌为营养苛求性菌(fastidiousbacteria)而不容易以人工培养，造成霉浆菌疫苗的价格居高不下。为了降低霉浆菌疫苗的成本，学者不断研究以不同的策略来研发疫苗，包括：(1)减毒疫苗、(2)载体疫苗、(3)亚单位疫苗、及(4)DNA疫苗；其中，亚单位疫苗因具有容易生产及安全性高的优点，而最具应用潜力。目前已知部分可研制为猪霉浆菌亚单位疫苗的可能候选抗原，但截至今日，领域中仍尚未有研究报告完整地提出适用于猪霉浆菌亚单位疫苗的抗原。
技术实现思路
于是，本专利技术的一目的为提供适用于猪霉浆菌亚单位疫苗的抗原，并据以制得亚单位疫苗，以降低防疫成本。本专利技术的又一目的为组合本专利技术所得的适用于猪霉浆菌亚单位疫苗的抗原，以制得效果更优良的亚单位疫苗，提供防疫工作更多样化的选择。为达到上述目的，本专利技术提供一种用于制备防治霉浆菌感染的疫苗的重组蛋白质，其具有SEQIDNO：08、SEQIDNO：09、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、或其组合所示的氨基酸序列。本专利技术又提供一种防治霉浆菌感染的疫苗，其包含：活性成分，其是包含PdhA、XylF、EutD、Mhp145、P78、P132、Mhp389、或其组合的蛋白质；及医药可接受的佐剂。较佳地，前述活性成分的浓度为50至3500μg/mL，其是以前述疫苗的总体积为基础。较佳地，前述活性成分包含下列群组的蛋白质的至少两种：PdhA、XylF、EutD、Mhp145、P78、P132、及Mhp389。较佳地，前述活性成分为PdhA及P78。较佳地，前述活性成分为XylF及Mhp145。较佳地，前述医药可接受的佐剂为：弗氏完全或不完全佐剂、铝胶、表面活性剂、聚阴离子、肽、油乳液或其组合。较佳地，前述疫苗，其进一步包含医药可接受的添加剂。较佳地，前述医药可接受的添加剂为溶剂、安定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂、等张剂、吸收延缓剂或其组合。本专利技术再提供一种防治霉浆菌感染的疫苗，其包含：活性成分，其具有SEQIDNO：08、SEQIDNO：09、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14、或其组合所示的氨基酸序列；及医药可接受的佐剂。较佳地，前述活性成分的浓度为50至3500μg/mL，其是以前述疫苗的总体积为基础。较佳地，前述活性成分具有下列群组的氨基酸序列的至少两种：SEQIDNO：08、SEQIDNO：09、SEQIDNO：10、SEQIDNO：11、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、及SEQIDNO：14。较佳地，前述活性成分具有SEQIDNO：08及SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。较佳地，前述活性成分具有SEQIDNO：09及SEQIDNO：11所示的氨基酸序列。较佳地，前述医药可接受的佐剂为：弗氏完全或不完全佐剂、铝胶、表面活性剂、聚阴离子、肽、油乳液或其组合。较佳地，前述疫苗进一步包含医药可接受的添加剂。较佳地，前述医药可接受的添加剂为溶剂、安定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂、等张剂、吸收延缓剂或其组合。本专利技术更提供一种用于制备防治霉浆菌感染的疫苗的表达载体，其包含质粒，前述质粒包含：核苷酸序列，其是选自下列群组的核苷酸序列中的至少一个：SEQIDNO：01、SEQIDNO：02、SEQIDNO：03、SEQIDNO：04、SEQIDNO：05、SEQIDNO：06、及SEQIDNO：07；及调控元件。较佳地，前述调控元件包含启动子及核糖体结合部位。较佳地，前述质粒为pET-MSY、pET-YjgD、pET-D、或pET-SUMO。较佳地，前述质粒进一步包含融合伴侣(fusionpartner)基因。较佳地，前述融合伴侣基因为大肠杆菌的msyB基因、yjgD基因、Lambda噬菌体D蛋白质基因、或面包酵母菌(Saccharomycescerevisiae)SUMO蛋白质基因。较佳地，前述表达载体是用于大肠杆菌表达系统的表达载体。综上所述，本专利技术关于适用于作为猪霉浆菌亚单位疫苗的活性成分的抗原，以及以其制得的亚单位疫苗。本专利技术的亚单位疫苗不仅可有效运用于防疫工作而降低防疫成本，本专利技术的揭露内容更教示了组合两种以上抗原的“鸡尾酒”亚单位疫苗(即，含有两种以上的抗原作为活性成分)具有更加强的免疫诱发效果。附图说明图1是本专利技术实施例一的蛋白质二维电泳图谱。图2是本专利技术实施例一的蛋白质印迹法(Westernblot)的呈色反应结果。图3是本专利技术实施例二的PCR产物的电泳结果。图4是显示本专利技术实施例三的攻毒试验的结果纪录。符号说明1XylF(木糖结合脂蛋白)2XylF(木糖结合脂蛋白)3XylF(木糖结合脂蛋白)4PdhA(丙酮酸去氢酶α次单位)5Mhp145(周质空间糖结合蛋白质)6EutD(磷酸乙酰转移酶)7EutD(磷酸乙酰转移酶)8Mhp3899P78(脂蛋白)10P132具体实施方式本专利技术的研发概念在于利用蛋白质二维电泳技术结合免疫学技术筛选技术以搜寻出合适作为次单元疫苗的候选抗原，并以质谱仪分析鉴定抗原身份。最后再经动物实验以确认本专利技术的次单元疫苗的效果。本专利技术的研发过程简述如下：(1)以市售的猪霉浆菌疫苗于实验猪只体内建立免疫反应，并采集含有抗猪霉浆菌的抗体的血清。(2)取得猪霉浆菌的全蛋白质(totalprotein)，并进行蛋白质二维电泳。(3)以前述步骤(1)中所得的血清作为一次抗体与步骤(2)中的蛋白质二维电泳结果进行杂合，经二次抗体杂合放大及后续显影程序后，采集有成功显影的蛋白质(即，候选抗原)。(4)辨识步骤(3)中所获得的候选抗原。(5)以大肠杆菌表达系统大量表达前述候选抗原，并据以制得亚单位疫苗。(6)以猪只免疫攻毒实验测试前述亚单位疫苗降低肺部病变的效果，以确认前述候选抗原中何者具有作为亚单位疫苗的活性成分的价值。本专利技术的防治霉浆菌感染的疫苗包含：活性成分及医药可接受的佐剂。在本专利技术的一个实施态样中，前述活性成分可为PdhA、XylF、EutD、Mhp145、P78、P132、Mhp389之蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种防治霉浆菌感染的组合物，其包含：活性成分，其是包含PdhA；所述PdhA的氨基酸序列由SEQIDNO：08所组成；及医药可接受的佐剂。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述活性成分为PdhA及p78；所述P78的氨基酸序列由SEQIDNO：12所组成。3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述活性成分的浓度为50至3500μg/mL，其是以所述组合物的总体积为基础。4.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：林俊宏，王志鹏，谢明伟，陈正文，方健宇，刘学陶，杨平政，
申请(专利权)人：财团法人农业科技研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71