本发明专利技术提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其中抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术通过对兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株主要保护性抗原蛋白基因PPP的PCR扩增，利用PET32a(+)表达性载体构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPP的基因工程重组大肠杆菌BL21宿主菌。经SDS‑PAGE分析，表达出了46.2kDa重组融合目的蛋白。将融合蛋白纯化并复性后制备成基因工程亚单位氢氧化铝胶疫苗。将该亚单位苗按照1.0ml/只剂量皮下注射免疫体重1.5kg左右的家兔，免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株按照100LD50进行攻毒，保护率为10/10。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗。
技术介绍
兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发。主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天气突变，兔的抵抗力下降，兔舍卫生不好，空气污浊等情况下，均可引起本病发生。本病的潜伏期7～10d。成年兔表现鼻炎和支气管炎。有多量的浆液性、黏液性鼻液流出。鼻炎长期不愈，鼻腔流出黏液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸困难，不食，消瘦等。仔兔多呈急性经过，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病变为鼻炎、化脓性鼻气管炎、化脓性支气管肺炎，个别的出现败血病变化。鼻腔、气管黏膜充血、水肿。鼻腔内有浆液性、黏液性或黏液脓性分泌物。在肺门支气管周围到肺的边缘见有支气管肺炎病灶。病变多见于心叶、尖叶，严重的病例，波及全肺叶。病变部隆起、坚硬，呈暗红色，褐色，进而为灰黄色。有些病例肺上有大小不等的脓疮。严重的占肺部的90％以上。有的肝脏表面有黄豆至蚕豆大的脓疮。脓疮破后可见黏稠的奶油状乳白色的脓汁。还见有心包炎、胸膜炎、胸腔积脓及肌肉脓肿等。兔支气管败血波氏杆菌病主要采用生物安全措施和疫苗预防接种。其中生物安全措施主要包括：加强饲养管理，改善饲养环境，做好防疫工作；兔场最好坚持自繁自养；对新引进的兔，必须隔离观察1个月以上，经细菌学与血清学检查为阴性者方可入群。本病常与巴氏杆菌混合感染，兔群一旦发病，必须查明原因，消除外界刺激因素，隔离感染兔，以控制病原传播。兔支气管败血波氏杆菌病较难治愈，需要加强规模化兔场的免疫，目前主要用分离到的支气管败血波氏杆菌制成灭活菌苗，进行预防接种，每只兔皮下注射1mL，每年2次；也有用兔巴氏杆菌—波氏杆菌二联苗或巴氏杆菌—波氏杆菌—兔病毒性出血症三联苗预防接种(杜雅楠等,2006；黄艳艳等,2006)。但兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗容易出现细菌毒素残留问题，常导致免疫兔发病，因此，目前迫切需要一种能够防控该病的安全性、效力好的疫苗，从而弥补现有技术的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，即通过原核表达载体构建出能表达兔支气管败血波氏杆菌PPP蛋白的大肠杆菌BL21重组基因工程菌，从而制备出兔支气管败血波氏杆菌基因工程重组亚单位疫苗，弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种新型的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白PPP，其氨基酸序列为SEQIDNO:2；编码上述抗原蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQIDNO:1。本专利技术再一个方面提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其中抗原为兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPP，其氨基酸序列为SEQIDNO:1；上述的基因工程亚单位疫苗，优选为氢氧化铝胶苗；本专利技术所提供的兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗中，主要保护性抗原蛋白PPP的含量优选不少于160μg/ml；本专利技术的兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其制备方法包含如下的步骤：1)将兔支气管败血波氏杆菌接种于TSB培养基37℃培养过夜，次日，5000r/min离心5min，吸尽上清弃掉，提取细菌总DNA作为模板；2)通过PCR方法扩增出兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原PPP基因，回收PPP基因目的片段；3)将PPP基因的目的片段按正确阅读框架插入表达载体pET32a(+)中，构建成表达重组质粒；4)将构建的表达重组质粒通过转化BL21宿主菌,构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌的基因工程重组大肠杆菌；用该重组基因工程菌表达出兔支气管败血波氏杆菌PPP蛋白；5)对融合蛋白进行纯化、复性后，加入氢氧化铝胶相制成疫苗。本专利技术利用pET32a(+)表达性载体构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌主要抗原蛋白基因(PPP)的基因工程重组大肠杆菌BL21宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了46.2kDa重组融合目的蛋白。将融合蛋白纯化并复性后制备成基因工程亚单位氢氧化铝胶疫苗，免疫体重1.5kg左右的家兔，免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(LD50为4.8×105CFU)按照100LD50进行攻毒,保护率100％。附图说明图1：本专利技术的兔支气管败血波氏杆菌的分离及培养图；图2：玻片凝集试验图；其中左(阳性菌)、中(样品菌)和右(生理盐水)图3：兔支气管败血波氏杆菌PPP基因PCR扩增的核酸电泳图；其中左(PPP基因)、中(阴性对照)和右(DL5000Marker)。图4：兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPPSDS-PAGE图；其中左(ProteinMarker)、中(阴性菌蛋白对照)和右(阳性菌PPP蛋白)。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述实施例1抗原蛋白PPP的筛选及序列分析从山东省潍坊某兔场购进一批1.5～3.0kg兔子做猪瘟脾淋苗试验，出现以发病急、死亡快，口鼻出血，肺脏出血、淤血为特征的疾病，根据发病死亡兔的临床表现、剖检病变，初步怀疑兔巴氏杆菌或兔支气管败血波氏杆菌感染，于是取肺脏组织进行了细菌的分离和培养，进行玻片凝集试验进行验证；对培养单菌落进行16s和巴氏杆菌(Pm)基因或波氏杆菌(Bb)基因的PCR扩增，并克隆、测序，确诊该批兔是由兔支气管败血波氏杆菌感染引起的死亡。1.1发病情况从山东潍坊购进一批1.5～3.0kg兔子做猪瘟脾淋苗测温试验，该批兔子只免疫过兔瘟疫苗，其它疫苗均未免疫，整体状态良好。1.2临床及剖检症状一只体重大概2kg左右试验兔子，突然死亡，口鼻喷血，死前一天精神状态、采食和饮水良好，无任何疾病症状，无打斗外伤，发病兔口鼻出血，肺脏出血、淤血，肝脏有一叶成黄白色。1.3实验室诊断1.3.1细菌分离和培养初步怀疑兔巴氏杆菌或兔支气管败血波氏杆菌感染，于是无菌取发病兔肺部组织病料均匀接种于巧克力琼脂平板培养基上，培养24小时形成中等菌落，呈灰白色，表面湿润、光滑，边缘整齐。详见图1。1.3.2细菌鉴定1.3.2.1革兰氏、美兰染色鉴定经革兰氏染色并在显微镜下观察确定，革兰氏染色为红色小球杆菌，表明该菌为革兰氏阴性菌；用美蓝染色，镜检，可见多形态、两极染色的小杆菌。1.3.2.2玻片凝集试验鉴定采用兔支气管败血波氏杆菌阳性血清鉴定该分离样品菌，并用兔支气管败血波氏杆菌阳性菌和生理盐水分别做阳性和阴性对照，具体结果见图2。1.3.3.3PCR鉴定利用检测原核生物用16S通用引物和巴氏杆菌(Pm)特定引物及设计的波氏杆菌(Bb)特定引物(上、下游引物序列详见表1)对单个菌落进行PCR扩增，并于1％琼脂糖凝胶中电泳，详见图3。表1引物序列表1.3.3.4目的基因序列测定将16S和Bb目的基因分别送上海生工测序，测序结果分析表明，该菌为兔支气管败血波氏杆菌，命名为QDBb01株。兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(RabbitBordetellabronchisepticaQDBb01)，于2016年11月01日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M201660本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新型的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
【技术特征摘要】
1.一种新型的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。2.一种编码基因，其特征在于，所述的编码基因用于编码权利要求1所述的抗原蛋白。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。4.一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求1所述的抗原蛋白。5.一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原包含有权利要求1所述的抗原蛋白。6.如权利要求4或5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗为氢氧化铝胶苗。7.如权利要求4或5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗中抗原蛋白的含量不少于160μg/ml。8.权利要求4或5所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下的步骤：1)将兔支气管败血波氏杆菌接种于TSB培养基37℃培养过夜，次日，5000r/...
【专利技术属性】
技术研发人员：张恒，张会，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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