新颖重组博德特氏菌菌株制造技术

本发明专利技术涉及一种遗传学上减毒的百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含一种突变的百日咳毒素(ptx)基因和一种异源amp G基因并且对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和不同于FHA的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的杂合蛋白质进行表达，其中编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。本发明专利技术进一步提供一种用于治疗粘膜或全身性感染性疾病的活减毒疫苗，该活减毒疫苗包含如上所定义的百日咳博德特氏菌菌株，意图引发一种针对造成全身性或粘膜感染(包括上呼吸道或下呼吸道)的病原体的免疫反应。本发明专利技术还涉及一种用于预防一种哺乳动物的一种感染性疾病的方法，该方法包含向所述哺乳动物给予有效量的一种疫苗，该疫苗在一种适合的媒剂中包含一种遗传学上减毒的百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含一种突变的百日咳毒素(ptx)基因和一种异源amp G基因并且对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和不同于FHA的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的杂合蛋白质进行表达，其中编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。本发明专利技术提供一种用于增强一种哺乳动物对一种病原体的免疫反应的方法，该方法包括给予基于一种博德特氏菌重组载体的一种疫苗，其中所述博德特氏菌对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和该免疫反应被寻求用来抵抗的所述病原体的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的一种融合蛋白质进行表达，并且其中在所述重组菌株中，编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】新颖重组博德特氏菌菌株 专利
： 本专利技术涉及对一种异源蛋白质进行表达的新颖遗传学上减毒的百日咳博德特氏 菌菌株和其作为疫苗，即用于粘膜免疫接种的用途。 本专利技术进一步涉及一种用于增加一种博德特氏菌菌株的免疫原性的方法。 专利技术背景： 例如疫苗的经鼻递送等粘膜免疫接种具有多种优于经典肠胃外疫苗接种的优势。 它们无针，不易受到污染，不太依赖于经过训练的医疗或辅助医务人员，可以诱导全身性和 粘膜免疫性并且可能更适合于保护免受粘膜感染。 但是，当经鼻提供时大部分抗原是不佳的免疫原并且需要添加有效的粘膜佐剂。 最有效的粘膜佐剂之一是霍乱毒素或紧密相关的大肠杆菌不耐热肠毒素和其解毒衍生物。 令人遗憾的是，将这种佐剂添加到经鼻疫苗配制品中已引起了贝尔麻痹（Bell's palsy) (穆施（Mutsch)等人，2004)并且因此不可以在人类中使用。 本专利技术的作者最近研发了一种对抗百日咳的经鼻的活减毒候选疫苗（米埃尔卡 雷克（Mielcarek)等人，2006)，该疫苗现在成功地完成首次人体I期安全试验（索斯滕松 (Thorstensson)等人，准备中）。这一候选疫苗的概念是基于以下发现：通过气雾剂暴露的 百日咳博德特氏菌自然感染甚至在极幼小婴儿中也能够诱导强烈的全身性B和T细胞反应 (马斯卡特（Mascart)等人，2003)，以及粘膜免疫性。此外，在非人类灵长类动物中的先前 研宄得出了"抗百日咳的最终保护可能最佳由活百日咳博德特氏菌接种产生"（黄（Huang) 等人，1962)的结论。 百日咳博德特氏菌菌株是基于百日咳博德特氏菌毒性的分子机制的知识（洛赫 特（Locht)等人，2001)减毒的并且通过在遗传学上使百日咳毒素失活，通过使皮肤坏死毒 素基因缺失并且通过将百日咳博德特氏菌的ampG基因交换成大肠杆菌ampG，由此消除气 管细胞毒素的产生来构建。在临床前模型中，这一名为BPZEl的候选疫苗显示极好的安全 性（米埃尔卡雷克等人，2006, 2010 ;斯凯利（Skerry)等人，2009 ;卡瓦纳（Kavanagh)等人， 2010;李（Li)等人，2010)并且在单一经鼻给予后诱导快速、强烈且持久的免疫性（弗努 (Feunou)等人，2010)。 此外，出人意料地发现，当向小鼠经鼻给予时，BPZEl菌株能够引发抵抗气道的过 敏和发炎病状（即哮喘）并且还抵抗异位性过敏的保护性反应。 雷夫诺（Reveneau)等人披露一种缺乏毒素产生并且对包含丝状血凝素（FHA)的 N-端片段和保护性破伤风毒素片段C(TTFC)的杂合蛋白质进行表达的遗传学上减毒的博 德特氏菌菌株，该菌株不产生成熟FHA。 科彭斯（Coppens)等人披露一种缺乏毒素产生并且对包含丝状血凝素（FHA)的 N-端片段和脑膜炎双球菌的TbpB的杂合蛋白质进行表达的遗传学上减毒的博德特氏菌菌 株，该菌株不产生成熟FHA。 阿隆索（Alonso)等人披露一种缺乏毒素产生并且对包含丝状血凝素（FHA)的 N-端片段和不可分型流感嗜血杆菌的HtrA蛋白质的杂合蛋白质进行表达的遗传学上减毒 的博德特氏菌菌株，该菌株不产生成熟FHA US 6841358披露一种缺乏毒素产生并且对包含丝状血凝素（FHA)的N-端片段和 曼氏裂体吸虫的Sm28GST的一种模式肽的杂合蛋白质进行表达的遗传学上减毒的博德特 氏菌菌株，该菌株缺乏成熟FHA的产生 但是，出于增加免疫原性的目的，fhaB基因不缺失，而缺失仅仅是巧合并且是用作 异源抗原产生的载体的菌株的固有特征。 随后BPZEl被认为是表达异源保护性抗原的一种载体，以便研发出能够同时抵抗 数种不同病原体的多价经鼻疫苗。来自肠道病毒71的中和肽SP70被BPZEl作为与丝状血 凝素（FHA)的杂合蛋白质并且使用FHA的分泌机制暴露表面和分泌（胡（Ho)等人，2008)。 类似地，FHA机制也用于通过BPZEl分泌并且暴露来自A型流感病毒的基质蛋白2的胞外 域（李（Li)等人，2011)。尽管全身和局部IgG和IgA反应可以在给予重组BPZEl衍生物 后引发到异源抗原，但对过客抗原的免疫反应通常最多是适度的。 在试图解决用BPZEl构建体获得的不佳免疫原性的问题时，诸位专利技术人意外地发 现，当编码天然存在的FHA蛋白质的天然fhaB基因缺失或者以其他方式失活时免疫原性可 以显著增加。 此外，尽管如通过其抗哮喘和过敏疾病的活性所证明的百日咳博德特氏菌的天然 减毒菌株的消炎特性，由此获得的菌株显示实质上增加的免疫原性。因此本专利技术解决了用 于粘膜应用的疫苗的问题，它安全并且能够引发一种针对一种造成全身性或粘膜感染的病 原体，包括造成上呼吸道或下呼吸道感染的病原体中存在的抗原的有效免疫反应。 专利技术概述： 本专利技术提供一种遗传学上减毒的重组百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含一种突 变的百日咳毒素（PtX)基因和一种异源ampG基因并且对包含丝状血凝素（FHA)的N-端片 段和不同于FHA的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的一种杂合蛋白质进行表达， 其中编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。 本专利技术进一步提供一种用于治疗粘膜感染性疾病的活减毒疫苗，该活减毒疫苗包 含如上所定义的百日咳博德特氏菌菌株，意图引发一种针对造成粘膜（即上呼吸道或下呼 吸道）感染的一种病原体的免疫反应。 本专利技术还涉及一种用于预防一种哺乳动物中一种感染性疾病的方法，该方法包括 向所述哺乳动物给予有效量的疫苗，该疫苗在一种适合的媒剂中包含一种遗传学上减毒的 百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含一种突变的百日咳毒素（Ptx)基因和一种异源ampG基 因，对包含丝状血凝素（FHA)的N-端片段和不同于FHA的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋 白质片段的一种杂合蛋白质进行表达，其中编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。 在另一个方面，本专利技术进一步提供用于使一种哺乳动物免于被感染粘膜（即下呼 吸道或上呼吸道）的一种病原体感染和/或在一种哺乳动物中引发针对这类病原体的一种 免疫反应的方法，该方法使用本专利技术的组合物或疫苗。 在再另一个方面，本专利技术提供一种在一种哺乳动物中引发一种针对一种具有粘膜 趋向性的病原体的免疫反应的方法，该方法包括：向该哺乳动物给予一种重组减毒百日咳 博德特氏菌菌株，其中该突变的百日咳博德特氏菌菌株包含一种突变的百日咳毒素（Ptx) 基因和一种异源ampG基因并且对包含丝状血凝素（FHA)的N-端片段和免疫反应被寻求用 来抵抗的病原体的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的一种融合蛋白质进行表达， 其中在所述重组菌株中，编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。 在另一个方面，除突变的百日咳毒素（ptx)基因和异源ampG基因以外，重组菌株 进一步包含一种缺失或突变的皮肤坏死毒素（dnt)基因。在一些这类方面，野生型博德特 氏菌菌株ampG基因经其他革兰氏阴性细菌的一种ampG基因，例如大肠杆菌ampG基因替 换。 在其他方面，ptx基因的突变包含与底物结合相关的一种氨基酸和/或与催化相 关的一种氨基酸的取代。在一些这类方面，与底物结合相关的氨基酸的取代包含K9R，并且 与催化相关的氨基酸的取代包含E129G。在一些方面，百日咳博德特氏菌菌株包含一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种遗传学上减毒的百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含一种突变的百日咳毒素(ptx)基因和一种异源ampG基因并且对包含丝状血凝素(FHA)的N‑端片段和不同于FHA的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的杂合蛋白质进行表达，其中编码该天然FHA蛋白质的基因是失活的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡米尔·洛赫特，纳塔利·米耶尔卡雷克，哈娜·卡芒，
申请(专利权)人：国立健康与医学研究所，里尔巴斯德研究所，里尔第二大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR