新颖重组博德特氏菌菌株制造技术

本发明专利技术涉及新颖重组博德特氏菌菌株。本发明专利技术提供了一种遗传学上减毒的百日咳博德特氏菌菌株，其包含突变的百日咳毒素(ptx)基因和异源amp G基因并且对包含丝状血凝素(FHA)的N‑端片段和不同于FHA的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的杂合蛋白质进行表达，其中编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。本发明专利技术进一步提供用于治疗粘膜或全身性感染性疾病的活减毒疫苗，包含如上所定义的百日咳博德特氏菌菌株。本发明专利技术还涉及用于预防哺乳动物的感染性疾病的方法以及用于增强哺乳动物对病原体的免疫反应的方法，包含向所述哺乳动物给予有效量的疫苗，该疫苗包含如上所定义的百日咳博德特氏菌菌株。

A novel recombinant strain of Bordetella

【技术实现步骤摘要】
新颖重组博德特氏菌菌株本申请是申请日为2013年10月17日，申请号为201380053317.5，专利技术名称为“新颖重组博德特氏菌菌株”的申请的分案申请。
：本专利技术涉及对一种异源蛋白质进行表达的新颖遗传学上减毒的百日咳博德特氏菌菌株和其作为疫苗，即用于粘膜免疫接种的用途。本专利技术进一步涉及一种用于增加一种博德特氏菌菌株的免疫原性的方法。
技术介绍
：例如疫苗的经鼻递送等粘膜免疫接种具有多种优于经典肠胃外疫苗接种的优势。它们无针，不易受到污染，不太依赖于经过训练的医疗或辅助医务人员，可以诱导全身性和粘膜免疫性并且可能更适合于保护免受粘膜感染。但是，当经鼻提供时大部分抗原是不佳的免疫原并且需要添加有效的粘膜佐剂。最有效的粘膜佐剂之一是霍乱毒素或紧密相关的大肠杆菌不耐热肠毒素和其解毒衍生物。令人遗憾的是，将这种佐剂添加到经鼻疫苗配制品中已引起了贝尔麻痹(Bell'spalsy)(穆施(Mutsch)等人，2004)并且因此不可以在人类中使用。本专利技术的作者最近研发了一种对抗百日咳的经鼻的活减毒候选疫苗(米埃尔卡雷克(Mielcarek)等人，2006)，该疫苗现在成功地完成首次人体I期安全试验(索斯滕松(Thorstensson)等人，准备中)。这一候选疫苗的概念是基于以下发现：通过气雾剂暴露的百日咳博德特氏菌自然感染甚至在极幼小婴儿中也能够诱导强烈的全身性B和T细胞反应(马斯卡特(Mascart)等人，2003)，以及粘膜免疫性。此外，在非人类灵长类动物中的先前研究得出了“抗百日咳的最终保护可能最佳由活百日咳博德特氏菌接种产生”(黄(Huang)等人，1962)的结论。百日咳博德特氏菌菌株是基于百日咳博德特氏菌毒性的分子机制的知识(洛赫特(Locht)等人，2001)减毒的并且通过在遗传学上使百日咳毒素失活，通过使皮肤坏死毒素基因缺失并且通过将百日咳博德特氏菌的ampG基因交换成大肠杆菌ampG，由此消除气管细胞毒素的产生来构建。在临床前模型中，这一名为BPZE1的候选疫苗显示极好的安全性(米埃尔卡雷克等人，2006，2010；斯凯利(Skerry)等人，2009；卡瓦纳(Kavanagh)等人，2010；李(Li)等人，2010)并且在单一经鼻给予后诱导快速、强烈且持久的免疫性(弗努(Feunou)等人，2010)。此外，出人意料地发现，当向小鼠经鼻给予时，BPZE1菌株能够引发抵抗气道的过敏和发炎病状(即哮喘)并且还抵抗异位性过敏的保护性反应。雷夫诺(Reveneau)等人披露一种缺乏毒素产生并且对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和保护性破伤风毒素片段C(TTFC)的杂合蛋白质进行表达的遗传学上减毒的博德特氏菌菌株，该菌株不产生成熟FHA。科彭斯(Coppens)等人披露一种缺乏毒素产生并且对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和脑膜炎双球菌的TbpB的杂合蛋白质进行表达的遗传学上减毒的博德特氏菌菌株，该菌株不产生成熟FHA。阿隆索(Alonso)等人披露一种缺乏毒素产生并且对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和不可分型流感嗜血杆菌的HtrA蛋白质的杂合蛋白质进行表达的遗传学上减毒的博德特氏菌菌株，该菌株不产生成熟FHAUS6841358披露一种缺乏毒素产生并且对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和曼氏裂体吸虫的Sm28GST的一种模式肽的杂合蛋白质进行表达的遗传学上减毒的博德特氏菌菌株，该菌株缺乏成熟FHA的产生但是，出于增加免疫原性的目的，fhaB基因不缺失，而缺失仅仅是巧合并且是用作异源抗原产生的载体的菌株的固有特征。随后BPZE1被认为是表达异源保护性抗原的一种载体，以便研发出能够同时抵抗数种不同病原体的多价经鼻疫苗。来自肠道病毒71的中和肽SP70被BPZE1作为与丝状血凝素(FHA)的杂合蛋白质并且使用FHA的分泌机制暴露表面和分泌(胡(Ho)等人，2008)。类似地，FHA机制也用于通过BPZE1分泌并且暴露来自甲型流感病毒的基质蛋白2的胞外域(李(Li)等人，2011)。尽管全身和局部IgG和IgA反应可以在给予重组BPZE1衍生物后引发到异源抗原，但对过客抗原的免疫反应通常最多是适度的。
技术实现思路
：在试图解决用BPZE1构建体获得的不佳免疫原性的问题时，诸位专利技术人意外地发现，当编码天然存在的FHA蛋白质的天然fhaB基因缺失或者以其他方式失活时免疫原性可以显著增加。此外，尽管如通过其抗哮喘和过敏疾病的活性所证明的百日咳博德特氏菌的天然减毒菌株的消炎特性，由此获得的菌株显示实质上增加的免疫原性。因此本专利技术解决了用于粘膜应用的疫苗的问题，它安全并且能够引发一种针对一种造成全身性或粘膜感染的病原体，包括造成上呼吸道或下呼吸道感染的病原体中存在的抗原的有效免疫反应。本专利技术提供一种遗传学上减毒的重组百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含一种突变的百日咳毒素(ptx)基因和一种异源ampG基因并且对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和不同于FHA的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的一种杂合蛋白质进行表达，其中编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。本专利技术进一步提供一种用于治疗粘膜感染性疾病的活减毒疫苗，该活减毒疫苗包含如上所定义的百日咳博德特氏菌菌株，意图引发一种针对造成粘膜(即上呼吸道或下呼吸道)感染的一种病原体的免疫反应。本专利技术还涉及一种用于预防一种哺乳动物中一种感染性疾病的方法，该方法包括向所述哺乳动物给予有效量的疫苗，该疫苗在一种适合的媒剂中包含一种遗传学上减毒的百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含一种突变的百日咳毒素(ptx)基因和一种异源ampG基因，对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和不同于FHA的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的一种杂合蛋白质进行表达，其中编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。在另一个方面，本专利技术进一步提供用于使一种哺乳动物免于被感染粘膜(即下呼吸道或上呼吸道)的一种病原体感染和/或在一种哺乳动物中引发针对这类病原体的一种免疫反应的方法，该方法使用本专利技术的组合物或疫苗。在再另一个方面，本专利技术提供一种在一种哺乳动物中引发一种针对一种具有粘膜趋向性的病原体的免疫反应的方法，该方法包括：向该哺乳动物给予一种重组减毒百日咳博德特氏菌菌株，其中该突变的百日咳博德特氏菌菌株包含一种突变的百日咳毒素(ptx)基因和一种异源ampG基因并且对包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和免疫反应被寻求用来抵抗的病原体的一种异源表位或抗原蛋白质或蛋白质片段的一种融合蛋白质进行表达，其中在所述重组菌株中，编码天然FHA蛋白质的基因是失活的。在另一个方面，除突变的百日咳毒素(ptx)基因和异源ampG基因以外，重组菌株进一步包含一种缺失或突变的皮肤坏死毒素(dnt)基因。在一些这类方面，野生型博德特氏菌菌株ampG基因经其他革兰氏阴性细菌的一种ampG基因，例如大肠杆菌ampG基因替换。在其他方面，ptx基因的突变包含与底物结合相关的一种氨基酸和/或与催本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含缺失的皮肤坏死毒素(dnt)基因和编码包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和异源抗原的杂合蛋白质的基因，其中编码所述杂合蛋白质的基因被插入在缺失的dnt基因的基因座，并且该百日咳博德特氏菌菌株缺乏天然FHA蛋白质。/n

【技术特征摘要】
20121017 EP 12306279.61.一种百日咳博德特氏菌菌株，该菌株包含缺失的皮肤坏死毒素(dnt)基因和编码包含丝状血凝素(FHA)的N-端片段和异源抗原的杂合蛋白质的基因，其中编码所述杂合蛋白质的基因被插入在缺失的dnt基因的基因座，并且该百日咳博德特氏菌菌株缺乏天然FHA蛋白质。


2.如权利要求1所述的百日咳博德特氏菌菌株，其中该百日咳博德特氏菌菌株包含编码突变的百日咳毒素(ptx)基因的基因，所述突变的百日咳毒素(ptx)基因包含至少一种产生酶失活的蛋白质的突变，所述酶失活的蛋白质仍保持免疫原性特性。


3.如权利要求1所述的百日咳博德特氏菌菌株，其中该百日咳博德特氏菌菌株包含编码取代天然ampG基因的异源ampG基因的基因。


4.如权利要求3所述的百日咳博德特氏菌菌株，其中所述异源ampG基因来自...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡米尔·洛赫特，纳塔利·米耶尔卡雷克，哈娜·卡芒，
申请(专利权)人：国立健康与医学研究所，里尔巴斯德研究所，里尔大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR