本发明专利技术公开了一种分离纯化百日咳杆菌粘附素的方法，它包括以下步骤：样品处理：S1.收集百日咳杆菌菌体，菌体经重悬、浸提、离心去除沉淀，将上清液超滤浓缩并调pH值到7.0；S2.一次洗脱：上清液上样于CaptoAdhere层析柱上，用缓冲液洗脱，收集洗脱液；S3.透析：洗脱液在pH4.5～5.5、15～25mM NaAc溶液中进行透析脱盐，得透析液；S4.二次洗脱：透析液上样于CaptoSPImRes层析柱，洗脱并收集洗脱液即为纯化的百日咳杆菌粘附素。本发明专利技术采用CaptoAdhere层析柱、CaptoSPImRes层析柱对百日咳杆菌培养液的菌体进行分离纯化，所得抗原蛋白百日咳杆菌粘附素成分明确、质量可控，纯化方法具有操作简单、纯化速度快、成本低的优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，它包括以下步骤：样品处理：S1.收集百日咳杆菌菌体，菌体经重悬、浸提、离心去除沉淀，将上清液超滤浓缩并调pH值到7.0；S2.一次洗脱：上清液上样于CaptoAdhere层析柱上，用缓冲液洗脱，收集洗脱液；S3.透析：洗脱液在pH4.5～5.5、15～25mM NaAc溶液中进行透析脱盐，得透析液；S4.二次洗脱：透析液上样于CaptoSPImRes层析柱，洗脱并收集洗脱液即为纯化的百日咳杆菌粘附素。本专利技术采用CaptoAdhere层析柱、CaptoSPImRes层析柱对百日咳杆菌培养液的菌体进行分离纯化，所得抗原蛋白百日咳杆菌粘附素成分明确、质量可控，纯化方法具有操作简单、纯化速度快、成本低的优点。【专利说明】
本专利技术属于生物
，具体涉及。
技术介绍
百日咳(pertussis, whooping cough)是由革兰氏阴性百日咳杆菌引起的一种具有强传染性的呼吸系统疾病，典型症状为突然阵发性痉咳，并带有吸气性尾声或伴有呕吐，新生儿及婴幼儿患者会引起呼吸暂停和发绀。百日咳在发病初期传染力极强，不易诊断，因此进行疫苗接种是预防和控制百日咳最经济最有效的手段。 百日咳杆菌其致病物质主要包括百日咳毒素(Pertussis Toxin，PT)、丝状血凝素(Filamentous Hemagglutinin, FHA)、百日咳杆菌粘附素(Pertactin, PRN)、凝集原(Agglutinogens, AGGs)、腺苷酸环化酶毒素(Adenylate Cyclase Toxin, ACT)、气管细胞毒素(Tracheal Cytotoxin, TCT)和不耐热毒素(Heat-labile toxin, HLT)等多种生物活性物质，这些生物活性物质在百日咳杆菌的致病作用和引起宿主对疾病的免疫反应方面起着重要作用。目前市场上的百日咳疫苗主要有全菌体百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗两种，后者属于百日咳疫苗的升级产品，其仅含提纯的有效抗原而咩有百日咳菌体，因此大大降低了注射后的不良反应而保留了良好的免疫效果，因此被广泛使用。 无细胞百日咳疫苗的发展趋势，是通过纯化手段去除无用且引起副反应的组分(如HLT、TCT和ACT)，保留并提纯具有保护性免疫作用的抗原成分(如PT、FHA和PRN等)，传统的无细胞百日咳疫苗抗原制备工艺可以分为以下两种:1.离心共纯化工艺:我国和日本大部分厂商采用的离心共纯化工艺，即细菌培养液收获后，通过硫酸铵盐析、高盐溶液浸提和蔗糖密度梯度离心获得精制抗原，然后利用戊二醛溶液或者甲醛溶液将抗原脱毒为类毒素；但此种方法所需设备投资巨大，且此工艺生产的产品纯度不够高、产率也较低，不适宜大规模生产；2.柱层析:包括以下几种:(1)羟基磷灰石，结合珠蛋白柱层析和凝胶过滤法；(2)蓝胶亲和层析和胎球蛋白亲和层析法；(3)蓝胶亲和层析和羟基磷灰石层析法；(4)珍珠岩层析和羟基磷灰石柱层析；虽然使用这些工艺都可得到较纯的百日咳抗原PT和FHA，但(1)、 (2)、(3)工艺都有其不可避免的问题，例如:蓝胶亲和层析、胎球蛋白亲和层析、结合珠蛋白亲和层析法，层析填料的结合基团容易降解下来而影响疫苗质量。另外，洗脱液中含有毒物质或者洗脱条件过于苛刻，这些都会直接影响抗原产率和质量；工艺(4)虽可获得较高纯度和产率的PT和FHA，但菌苗培养物经珍珠岩柱层析分离纯化后，PT和FHA的纯度只能达到62%-68%，还要经过羟基磷灰石柱层析分离纯化，PT和FHA的纯度才能达到90%左右，羟基磷灰石价格昂贵，并且此步大约10%的PT和FHA损失掉。且无细胞百日咳疫苗抗原制备工艺大多是关于PT和FHA，对PRN分离纯化的报道很少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供，本专利技术采用Capto Adhere层析柱、Capto SP ImRes层析柱对百日咳杆菌培养液的菌体进行分离纯化，所得抗原蛋白百日咳杆菌粘附素成分明确、质量可控，纯化方法具有操作简单、纯化速度快、成本低的优点。 本专利技术的目的通过以下技术方案来实现:，它包括以下步骤:51.样品处理:收集百日咳杆菌菌体，菌体经重悬、浸提、离心去除沉淀，将上清液用30KD截留分子量膜包超滤浓缩至原体积的1/15?1/10，并调pH值到7.0 ；52.一次洗脱:将上清液上样于用磷酸盐缓冲液平衡好的Capto Adhere层析柱上，依次用A液、B液、C液、D液洗脱，收集D液的洗脱液，即为百日咳杆菌粘附素粗品； 其中，所述 A 液为 pH7.0,15 ?25mM ΡΒ、0.7 ?1.3Μ NaCl，B 液为 pH4 ?5，15 ?25mMNaAC、0.7 ?1.3M NaCl，C 液为 pH4 ?5，15 ?25mM NaAC、0.1 ?0.5M NaCl，D 液为 pH4 ?5,15 ?25mM NaAC、0.03 ?0.07M NaCl ；53.透析:将百日咳杆菌粘附素粗品在pH4.5?5.5、15?25mM NaAc溶液中进行透析脱盐，得透析液；54.二次洗脱:将透析液上样于平衡好的Capto SP ImRes层析柱，用pH 4.5?5.5、15?25mM NaAc、0.1?0.2M NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液即为纯化的百日咳杆菌粘附素。 进一步地，步骤S1所述样品处理的具体操作为:百日咳杆菌培养液降温至2?8°C，离心去除上清液，收集菌体，将收集到的菌体在pH8?9、90?llOmM Tris、130?170mMNaCl缓冲液中重悬，每克菌体加入8?12ml缓冲液，将上清液用30KD截留分子量膜包超滤浓缩至原体积的1/15?1/10，用40?60%的醋酸调pH值到7.0。 进一步地，步骤S4中所述Capto SP ImRes层析柱采用20mM NaAC, ρΗ5.0的溶液平衡。 本专利技术具有以下优点:本专利技术采用Capto Adhere层析柱、Capto SP ImRes层析柱对百日咳杆菌培养液的菌体进行分离纯化，所得抗原蛋白百日咳杆菌粘附素成分明确、质量可控，分离纯化百日咳杆菌粘附素的纯度达到99%，纯化方法具有操作简单、纯化速度快、成本低的优点。 【专利附图】【附图说明】 图1为本专利技术一次洗脱的层析图谱；图2为本专利技术二次洗脱的层析图谱；图3为本专利技术分离纯化的百日咳杆菌粘附素纯度分析电泳图。 【具体实施方式】 下面结合附图及实施例对本专利技术做进一步的描述，本专利技术的保护范围不局限于以下所述。实施例1:，它包括以下步骤:S1.样品处理:百日咳杆菌培养液降温至2?8°C，离心去除上清液，收集菌体，将收集到的菌体在pH8、90mM Tris、130mM NaCl缓冲液中重悬，每克菌体加入8ml缓冲液，将上清液用30KD截留分子量膜包超滤浓缩至原体积的1/15，用40%的醋酸调pH值到7.0 ； 52.一次洗脱:将上清液上样于用磷酸盐缓冲液平衡好的Capto Adhere层析柱上，依次用 A 液(pH7.0、15mM ΡΒ、0.7Μ NaCl )、Β 液(pH4，15mM NaAC、0.7M NaCl )、C 液(pH4，15mMNaAC、0.1M NaCl )、D液(p本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离纯化百日咳杆菌粘附素的方法，其特征在于，它包括以下步骤：S1. 样品处理：收集百日咳杆菌菌体，菌体经重悬、浸提、离心去除沉淀，将上清液用30KD截留分子量膜包超滤浓缩至原体积的1/15～1/10，并调pH值到7.0；S2. 一次洗脱：将上清液上样于用磷酸盐缓冲液平衡好的Capto Adhere层析柱上，依次用A液、B液、C液、D液洗脱，收集D液的洗脱液，即为百日咳杆菌粘附素粗品；其中，所述A液为pH7.0、15～25mM PB、0.7～1.3M NaCl，B液为pH4～5，15～25mM NaAC、0.7～1.3M NaCl，C液为pH4～5，15～25mM NaAC、0.1～0.5M NaCl，D液为pH4～5，15～25mM NaAC、0.03～0.07M NaCl；S3. 透析：将百日咳杆菌粘附素粗品在pH 4.5～5.5、15～25mM NaAc溶液中进行透析脱盐，得透析液；S4. 二次洗脱：将透析液上样于平衡好的Capto SP ImRes 层析柱，用pH 4.5～5.5、15～25mM NaAc、0.1～0.2M NaCl溶液进行洗脱，收集洗脱液即为纯化的百日咳杆菌粘附素。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈道远，吴强，马礼耕，伍长华，陈克平，
申请(专利权)人：成都欧林生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51
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