本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种从大肠杆菌中制备纯化Ｅｘｅｎｄｉｎ－４的工艺。将Ｅｘｅｎｄｉｎ－４高产工程菌株经细菌培养、非变性亲和层析、用肠激酶去除Ｎ端融合肽步骤得到纯化的Ｅｘｅｎｄｉｎ－４。和现有技术相比，本发明专利技术对裂解液和洗脱液的配方作出了改进，采用梯度洗脱工艺，从而增加了目的蛋白的产量和纯度，另外本发明专利技术简化了操作程序，操作步骤简便易行，适合工业化大批生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及Exendin—4的纯化工艺，具体涉及一种从大肠杆菌中制备纯 化Exendin—4的工艺。
技术介绍
利用基因工程方法制备有经济价值的蛋白质成功的关键在于，其一是筛 选高产菌株，其二在于优化纯化方案，提高目的蛋白的纯度和产量。二者缺 一不可。尤其是象Exendin—4，含39个氨基酸残基、分子量仅4.2kD的小蛋 白纯化难度更大。由于其极高的经济价值(7000元/mg， 2-型糖尿病治疗的特 效新药)以及将来用于工业化生产，从大肠杆菌中制备纯化Exendin—4的工 艺极为重要，因为它决定了Exendin—4的产量、纯度及工业化生产的可行性。 Qiagene及Invitrogen两大国际生物公司建立了从大肠杆菌中制备目的蛋白的 纯化工艺，包括细菌培养、裂解、亲和层析纯化目的蛋白和用肠激酶切除N 端融合肽等，由于该工艺在裂解液配方、洗脱液配方和洗脱方法上还存在不 足，因此用该方法纯化的目的蛋白，尤其是Exendin—4的产量和纯度均不能 令人满意。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种操作工艺简单的 从大肠杆菌中制备纯化Exendin—4的工艺，用该工艺能获得高纯度、高产量 的Exendin—4。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的本专利技术的从大肠杆菌中制备纯化Exendin — 4的工艺是按下述步骤进行的(l )一个单克隆接种量200ml AMP—LB培养基，25C过夜静置培养12h; 然后在37。C， 220rpm条件下培养至菌液OD6(K)达到0.6后，置于冰上冷却， 加入IPTG至浓度为lmM，在3(TC、 220rpm条件下诱导6h，收获菌液于一 20'C保存备用。(2)将步骤(1)保存的菌液于冰上融化后，每克细菌用10ml裂解液悬 浮沉淀冰浴30min，超声波破碎；所用裂解液的组成为50mM NaH2P04、3500mMNaCl、 10mM咪唑、0.01 %Trition 100、 2%甘油、10mM(3-巯基乙醇、 0.1%PMSF、 lmMMgCl2、 lURNase、 lUDNase。(3)将上述裂解液于4。C， 8000rpm离心30min;将上清液与树脂按2:1 混合，4。C缓慢振荡吸附3h; 4°C， 300011)111离心51^11，弃去上清。-(4 )每10ml细菌裂解液向上述树脂中加入40ml漂洗缓冲液，4C缓慢 振荡30min; 4°C， 3000rpm离心5min,弃上清；用10ml漂洗缓冲液重悬浮树 脂，转移到层析柱中；收集漂洗缓冲液最后1.5ml，用于鉴定洗液中是否还有杂 蛋白。漂洗缓冲液组成为50mMNaH2PO4; 500 mMNaCl; 20 mM咪唑； pH8.0。(5) 先用洗脱液I以1.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液I ;再用洗脱 液II以1.5ml/min的流速洗脱，收集洗脱液II得到纯化融合蛋白；所用洗脱液 I的组成为50mMNaH2PO4、 500mMNaCl、 40 mM咪唑、2%甘油、lOmMp-巯基乙醇，；所用洗脱液II的组成为50mMNaH2PO4、 500mMNaCl、 80 mM 咪唑、2%甘油、lOmMp-巯基乙醇。(6) 每3mg重组Exendin—4加入1U肠激酶，4C消化6h，将酶消化液 与树脂混合吸附3h后，过层析柱得到的洗脱液即纯化的Exendin—4溶液。在步骤(5)中，所用洗脱液I的体积为llml，收集6.5ml后，再分部收 集3管，每管1.5ml。在步骤(5)中，所用洗脱液II的体积为9ml，每管1.5ml，共收集6管。由于本专利技术对裂解液和洗脱液的配方作出了改进，采用梯度洗脱工艺， 从而增加了目的蛋白的产量和纯度，另外本专利技术和现有技术相比，简化了操 作程序，操作步骤简便易行，适合工业化大批生产。附图说明图l是利用亲和层析分离纯化大肠杆菌中的重组Exendin-4，其中1:诱 导6h菌体；2-8: 40mM咪唑浓度洗脱液洗脱融合蛋白；9-14: 80mM咪唑浓度 洗脱液洗脱融合蛋白；7:纯度74.67%; 8:纯度75.69% ; 9:纯度86.39%; 10:纯度98.10%; 11-14:纯度100%。图2是用肠激酶去除重组Exendin-4的N端融合肽，其中1:重组Exendin-4融合蛋白；2:融合蛋白用肠激酶消化6h，3:纯化的Exendin-4。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本专利技术作详细说明。 1.试剂的配制(1 )裂解缓冲液100ml的配置50mMNaH2PO4 0.690gNaH2P04.H20(MW 137.99g/mol) 300mMNaCl1.754gNaCl(MW 58.44g/mol) 10mM咪唑 0.068g咪唑(MW 68.08g/mol)用NaOH调pH至8.0。 现用现力口:Trition 100， 0.01%;甘油，2%; p-巯基乙醇，10mM; PMSF， 0.1%;lOOmM MgCl2，lmM;lOOmM MnCl2,lmM; RNase， 1U; DNase， 1U(2 )漂洗缓冲液100ml的配制50mM NaH2PO40.690gNaH2P04.H20(MW 137.99g/mol)300mM NaCl 1.754g NaCl (MW 58.44g/mol)20mM咪唑0.068g咪唑(MW 68.08g/mol)用NaOH调pH至8.0。 现用现加:甘油，2%; (3-巯基乙醇，10mM (3 )洗脱缓冲液100ml的配制50mM NaH2P04 0.690g NaH2P04.H20(MW 137.99g/mol)300mM NaCl1.754g NaCl (MW 58.44g/mol)250mM咪唑 0.068g 咪唑(MW 68.08g/mol)用NaOH调pH至8.0。现用现加:甘油，2%; |3-巯基乙醇，10mM3. Exendin-4高产工程菌株的构建方法 (1 ) Exendin-4基因的改造将Genebank中登录编号为AAB22006的 Exendin-4基因改造为具有SEQ ID No.l所示核苷酸序列的Exendin-4基因；人工合 成Exendin-4基因，采用PCR方法，以5'GGTACCGACGACGACGACAAGC 3'为 正向引物，以5'CCATGGTTATCAAGATGGTGGCG 3'为反向引物，在Exendin-4 基因5'端加上限制性内切酶Kpnl位点；在KpnI位点后添加编码肠激酶识别位点 DDDDK的核酸序列GACGACGACGACAAG，使肠激酶识别位点的核酸序列与 Exendin-4基因紧密相连；在Exendin-4基因3'端添加两个相连的终止密码子TGATAA和限制性内切酶NcoI (CCATGG)位点；(2) 克隆载体pMD19-T-Exendin-4的构建利用PCR扩增的改造后的 Exendin-4，纯化后与pMD19-T载体连接，构建克隆载体pMD19-T-Exendin-4;(3) 高效表达载体pET-32a (+) - Exendin-4的构建用限制性内切酶Kpn I和Nco I双酶切pMD19-T-Exendin-4质粒，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从大肠杆菌中制备纯化Ｅｘｅｎｄｉｎ－４的工艺，其特征在于它是按下述步骤进行的： （１）一个单克隆接种量２００ｍｌ ＡＭＰ－ＬＢ培养基，２５℃过夜静置培养１２ｈ；然后在３７℃，２２０ｒｐｍ条件下培养至菌液ＯＤ６００达到０．６后，置于 冰上冷却，加入ＩＰＴＧ至浓度为１ｍＭ，在３０℃、２２０ｒｐｍ条件下诱导６ｈ，收获菌液于－２０℃保存备用； （２）将步骤（１）保存的菌液于冰上融化后，每克细菌用１０ｍｌ裂解液悬浮沉淀，冰浴３０ｍｉｎ，超声波破碎；所用裂解液的组成为：５０ ｍＭ ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ咪唑、０．０１％Ｔｒｉｔｉｏｎ １００、２％甘油、１０ｍＭβ－巯基乙醇、０．１％ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＭｇＣｌ↓［２］、１Ｕ ＲＮａｓｅ、１Ｕ ＤＮａｓｅ； （３）将上述裂解 液于４℃，８０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ；取上清液与Ｎｉ－树脂按２∶１混合，４℃缓慢振荡吸附３ｈ；４℃，３０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清； （４）向步骤（３）的树脂中加入细菌裂解液４倍体积的漂洗缓冲液，４℃缓慢振荡３０ｍｉｎ；４℃， ３０００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清；用１倍细菌裂解液体积的漂洗缓冲液重悬浮树脂，转移到层析柱中；收集漂洗缓冲液最后１．５ｍｌ，用于鉴定洗液中是否还有杂蛋白；漂洗缓冲液组成为：５０ｍＭ ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］；５００ｍＭＮａＣｌ；２０ｍＭ咪唑；ｐＨ ８．０； （５）先用洗脱液Ｉ以１．５ｍｌ／ｍｉｎ的流速洗脱，收集洗脱液Ⅰ；再用洗脱液Ⅱ以１．５ｍｌ／ｍｉｎ的流速洗脱，收集洗脱液Ⅱ得到纯化融合蛋白；所用洗脱液Ⅰ的组成为：５０ｍＭ ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］、５００ｍＭ Ｎ ａＣｌ、４０ｍＭ咪唑、２％甘油、１０ｍＭβ－巯基乙醇，；所用洗脱液Ⅱ的组成为：５０ｍＭ ＮａＨ↓［２］ＰＯ↓［４］、５００ｍＭ ＮａＣｌ、８０ｍＭ咪唑、２％甘油、１０ｍＭβ－巯基乙醇； （６）每３ｍｇ重组Ｅｘｅｎｄｉｎ－４加入１Ｕ肠激 酶，４℃消化６ｈ，将酶消化液与Ｎｉ－树脂混合后吸附３ｈ后，过层析柱得到的洗脱液即纯化的Ｅｘｅｎｄｉｎ－４溶液。...
【技术特征摘要】
1.一种从大肠杆菌中制备纯化Exendin-4的工艺，其特征在于它是按下述步骤进行的(1)一个单克隆接种量200ml AMP-LB培养基，25℃过夜静置培养12h；然后在37℃，220rpm条件下培养至菌液OD600达到0.6后，置于冰上冷却，加入IPTG至浓度为1mM，在30℃、220rpm条件下诱导6h，收获菌液于-20℃保存备用；(2)将步骤(1)保存的菌液于冰上融化后，每克细菌用10ml裂解液悬浮沉淀，冰浴30min，超声波破碎；所用裂解液的组成为50mM NaH2PO4、500mM NaCl、10mM咪唑、0.01％Trition 100、2％甘油、10mMβ-巯基乙醇、0.1％PMSF、1mM MgCl2、1U RNase、1U DNase；(3)将上述裂解液于4℃，8000rpm离心30min；取上清液与Ni-树脂按2∶1混合，4℃缓慢振荡吸附3h；4℃，3000rpm离心5min，弃去上清；(4)向步骤(3)的树脂中加入细菌裂解液4倍体积的漂洗缓冲液，4℃缓慢振荡30min；4℃，3000rpm离心5min，弃上清；用1倍细菌裂解液体积的漂洗缓冲液重悬浮树脂，转移到层析柱中；收集漂洗缓冲液最后1.5ml，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小纯，祖向阳，陈红歌，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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