本发明专利技术公开了一种在大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，该方法首先扩增大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS，然后构建重组表达载体并构建及诱导表达工程菌株，超声波破碎得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体，最后纯化得到水通道蛋白AqpZ；本发明专利技术实现了在大肠杆菌中高效表达麦芽糖结合蛋白-水通道蛋白AqpZ-多聚组氨酸二元标签融合蛋白，克服了传统超表达AqpZ对宿主细胞造成的毒性及形成不溶性包涵体问题；而且，通过本方法表达的水通道蛋白只需通过两轮的简单的亲和色谱分离就可以得到高纯度的水通道蛋白AqpZ，操作简单可适用于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种蛋白的表达和纯化方法，更具体地说，涉及ー种采用麦芽糖结合蛋白/多聚组氨酸ニ元标 签表达系统在大肠杆菌中表达和纯化得到水通道蛋白AqpZ的方法。
技术介绍
水分子的跨膜运输是生命的基本活动之一。水分子快速的跨膜运输是生物体得以迅速地适应细胞外环境渗透压变化的ー个重要的因素。水通道蛋白Aquaporins是重要固有蛋白的重要成员之一。它是水分子进出细胞专ー性的跨膜通道，因此在维持细胞内环境稳态发挥着重要的作用。水通道蛋白遍布整个生物界，从原核细菌到真核动植物都有水通道被鉴定出来。大肠杆菌水通道蛋白Aquaporin Z (AqpZ)是第一个被发现的原核生物水通道蛋白。由于AqpZ的发现，一系列新的水通道蛋白家族成员也被陆续解析出来。所以水通道蛋白AqpZ已经成为研究微生物水分子运输、生物物理，生理及结构的模式蛋白。AqpZ的分子晶体结构已经被逐步的解析清楚。AqpZ是由具有6个跨膜区域，5个相互连接的环和2个保守的NPA box (asparagines-proline-alanine)装配而成的。AcipZ的高度疏水性，经过強烈的压缩之后形成了高度稳定且具有SDS抗性(SDS-Resistance)。在中性条件下，即使1%的SDS也不能使它解聚。在功能上，AqpZ对水有极高的滲透性，且该过程所需活化能很低，而且AqpZ是个“纯”的水通道蛋白，不能够运输甘油和尿素等ー些小分子。研究表明重整到脂质体后，AqpZ表现出高度渗透系数(Pf=10*10_14 cm's^subunit^1)和低的渗透活化能(Ea=3. 8 kcal/mol)。以此速率,大约O. 14 μ g水通道蛋白AcipZ就能回收2. 4升的废水(每个人每天最低需水量)。由于AqpZ结构和功能上的优势，已被选作制备生物仿生复合膜的候选蛋白之一。但是缺乏有效手段获得足够量的AqpZ蛋白样品已成为该技术的主要瓶颈之一。主要由于AqpZ蛋白強烈的疏水性，它在细胞内的大量表达会造成细胞毒性，影响宿主细胞的正常代谢，因此其表达水平受到大大的限制，AqpZ在大肠杆菌体系的表达量仅仅只有2. 5 mg/L。有研究表明采用融合表达策略可以大大提高AqpZ的表达水平，但是大部分蛋白都是以包涵体形式存在，仍然不能大量获得具有生物功能的AqpZ。主要的原因是亲水性标签还不能够完全中和AqpZ強烈的疏水性。因此，很难满足结构学研究和制备基于水通道蛋白的水回收装置的要求。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的一种大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，它包括以下步骤(O大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS的扩增根据NCBI上的大肠杆菌水通道蛋白基因序列设计2对引物，通过设计引物在AqpZ基因的3’端人为的添加8个HIS亲和标签，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；根据pMAL-p2和pMAL_c5e这两个载体的多克隆位点特点，在第一引物的上下游分别加上及 HI和I限制性内切酶位点以适用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分别加上及 HI和历III限制性内切酶位点以适用于pMAL_c5e，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA (2)重组表达载体的构建将步骤I得到的带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的 DNA定向克隆到用同样的内切酶双酶切过的表达载体pMAL-p2和pMAL_C5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元标签重组表达载体pMAL-p2-AqpZ_HIS及pMAL-c5e-AqpZ_HIS ;将这两个二元标签重组表达载体化到大肠杆菌DH5 a感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素的LB平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，进行双酶切和测序鉴定; (3)工程菌株的构建及诱导表达将步骤2鉴定正确的的质粒转化到大肠杆菌表达宿主Rosetta (DE3)中，并接种到含有100 u g/mL氨苄霉素和34 u g/mL氯霉素的LB培养基中，在200-250转/分钟转速、30°C下培养过夜，得到种子液；然后，把种子液接种到SOC培养基摇瓶中，种子液与SOC培养基的体积比为1:50，在200-250转/分钟转速、30°C下培养至0D600为I. 5时加入IPTG至IPTG的摩尔浓度为0. 6 mM,并继续诱导培养8小时，然后5000转/分钟离心10分钟收集菌体，即得到超表达水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体； (4)超声波破碎步骤3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体，12000转/分钟离心10分钟后收集上清； (5)纯化步骤4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。本专利技术的的有益效果是 (1)通过PCR方法在大肠杆菌水通道蛋白AqpZ基因序列的3’-端人为的添加8个组氣酸标签，获得具有8 X组氣酸标签的基因序列； (2)将基因序列克隆于含MBP融合表达标签载体pMAL-p2及pMAL_c5e上，获得二元标签融合表达载体，使融合蛋白能够在大肠杆菌中高效表达，并避免了由于AqpZ强烈的疏水性对宿主细胞造成的毒性； (3)融合蛋白MBP-AqpZ-HIS为嵌膜表达保证了水通道蛋白空间折叠的正确性，为获得功能性AqpZ奠定了基础； (4)通过特异性酶切可以将标签MBP去除，后通过Co2+-NTA亲和层析可以获得高纯度AqpZ-HIS ； (5)首次利用二元标签表达系统用于膜蛋白水通道蛋白AqpZ的表达与分离纯化，对结构学研究和制备基于水通道蛋白的水回收装置具有重要意义。附图说明图I 为 pMAL-p2-AqpZ_HIS 质粒图谱； 图 2 为 pMAL-c5e-AqpZ_HIS 质粒图谱； 图3为融合蛋白在4种不同宿主诱导和不诱导培养6小时后的生物量及对应的融合蛋白表达水平柱状 图4为SDS-PAGE分析融合蛋白在4种宿主中的表达情况电泳图，图中为无诱导样品；图 5 为 Rosetta (DE3) /pMAL_p2-AqpZ_HIS 在 30°C下的生长曲线； 图6为SDS-PAGE分析在不同生长阶段(1，2，3，4，7小时)进行诱导对融合蛋白表达水平电泳图，图中“”为无诱导样品，marker ”为蛋白分子量标准；图7为不同浓度IPTG浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mM)诱导下融合蛋白的表达水平柱状 图8为SDS-PAGE分析不同浓度IPTG浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mM)诱导下融合蛋白的表达水平电泳图，图中“”为无诱导样品，“marker ”为蛋白分子量标准； 图9为不同诱导后培养时间下融合蛋白的表达水平曲线； 图10为SDS-PAGE分析不同诱导后培养时间下融合蛋白的表达水平电泳图，图中为无诱导样品，“marker”为蛋白分子量标准； 图11为融合蛋白MBP-AqpZ-HIS嵌膜表达的鉴定电泳图，图中，“Tot”破胞后上本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，它包括以下步骤 (O大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS的扩增根据NCBI上的大肠杆菌水通道蛋白基因序列设计2对引物，通过设计引物在AqpZ基因的3’端人为的添加8个HIS亲和标签，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；根据pMAL-p2和pMAL-c5e这两个载体的多克隆位点特点，在第一引物的上下游分别加上及 HI和5 / I限制性内切酶位点以适用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分别加上及 HI和沿/？i/ III限制性内切酶位点以适用于pMAL_c5e，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA (2)重组表达载体的构建将步骤I得到的带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同样的内切酶双酶切过的表达载体pMAL-p2和pMAL_C5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的ニ元标签重组表达载体pMAL-p2-AqpZ-HIS及pMAL-c5e-AqpZ-HIS ;将这两个ニ元标签重组表达载体化到大肠杆菌DH5CI感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素的LB平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，进行双酶切和测序鉴定; (3)工程菌株的构建及诱导表达将步骤2鉴定正确的的质粒转化到大肠杆菌表达宿主Rosetta (DE3)中，并接种到含有100 μ g/mL氨苄霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，在200-250转/分钟转速、30°C下培养过夜，得到种子液；然后，把种子液接种到SOC培养基摇瓶中，种子液与SOC培养基的体积比为1:50，在200-250转/分钟转速、30°C下培养至0D600...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志南，潘剑峰，黄磊，蔡谨，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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