昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法技术

本发明专利技术公开了一种昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，将家蚕质型多角体病毒（BmCPV）的多角体基因（polyhedrin）以及目的蛋白基因分别构建至pFastBac?Dual载体上的PH和P10启动子下面，通过重组获得同时表达多角体和目的蛋白的杆状病毒。本发明专利技术利用杆状病毒表达系统，同时将质型多角体蛋白基因和目的蛋白基因分别构建到pFastBacTMDual载体的PH与p10启动子下，并在目的蛋白与信号肽之间引入柔性链接肽，通过与病毒骨架重组，获得重组杆状病毒。通过该单一病毒感染Sf9或Sf21昆虫细胞，直接可以在细胞内产生所需要的包裹型蛋白，并且这种重组型的病毒也同样可以获得扩增。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种对蛋白质进行包裹的方法。
技术介绍
昆虫病毒多角体(polyhedra)是指昆虫病毒在感染宿主细胞后产生的多面体粒子，其主要用来包裹病毒粒子。它的功能是保护包裹的病毒颗粒免受不良环境的破坏，比如:高温、干燥、辐射等，以及它对各种蛋白分解酶也有抗性，并且在酸性条件下极其稳定，而在碱性环境下易溶解并释放出病毒粒子[I]。依据多角体在细胞内形成的部位可以分为核型多角体或质型多角体。近来国内外的研究发现质型多角体可以包裹异源蛋白，比如:Ijiri等人将蛋白激酶C (protein kinase C)包裹进入了质型多角体中，并发现包裹型的蛋白激酶C相对于没有经过包裹的蛋白有更强生物学活性和持续的药物缓释效果[2];被多角体包裹的表皮生长因子(epidermal growth factor)不仅药效延长了，而且其能抵抗高强度的射线破坏[3];曹翠平等人利用多角体包埋外源蛋白时发现，经过包埋的EGFP蛋白(绿色荧光蛋白)放置2个月后仍能检测到绿色荧光，而干燥处理30min后同样能检测到蛋白活性[4]。这些研究表明多角体是耐酸、抗辐射、抗干燥并具有包裹异源活性蛋白特性的优良载体。目前国外文献报道 中关于多角体包裹目的蛋白的技术手段多是通过构建两个重组杆状病毒，即一个专一表达质型多角体病毒多角体蛋白(包裹蛋白)的杆状病毒，另一个专一表达目的蛋白的杆状病毒，通过调节两种病毒的比例混合感染Sf9昆虫细胞，再从细胞中分离出多角体。该种方法不适合从昆虫细胞中收集大量的多角体，由于很多细胞在混合感染的时候只感染了一种 病毒，所以会形成较多空多角体，以至于包裹效率低。国内学者主要通过家蚕Bacmid表达系统， 采用家蚕本身的多角体蛋白包裹目的蛋白，这种方案产生的多角体量大，并且可以通过家蚕本身生产，但采用家蚕本身多角体包裹的目的蛋白并不专一，其中包裹了大量家蚕病毒粒子，不适合现在国际上通过多角体专一包裹目的蛋白的发展趋势，也不能应用于现代医药蛋白或疫苗抗原的包裹需求。在细胞内实现多角体对目的蛋白的包裹过程需要一个信号肽蛋白的辅助，目前的技术手段基本上采用在目的蛋白的N端加上一段VP3蛋白N末端42-93个氨基酸或者Hl螺旋作为信号肽，由于这些蛋白结构比较大，可能会影响很多目的蛋白的正确折叠过程，造成目的蛋白失去生物学活性。大多数的生物活性蛋白，如:GM_CSF、干扰素、白介素、亚单位疫苗等，目前主要以注射给药，治疗不方便，也难以长期给药，由其是养殖场。我们尚未见到利用昆虫生产多角体包裹药物方面的研究报道。上文中涉及的参考文献如下:[l]Belloncik, S.and H.Mori, Cypoviruses.The insectviruses, 1998:p.337-369.(Belloncik, S.and H.Mori,质型多角体病毒。昆虫病毒杂志，1998:p.337-369)。[2]Ijiri, H., et al., Immobilization of protein kinase C into cypoviruspolyhedra.Journal of insect biotechnology and sericology.79(1):p.1-1.(H.;Hamada, N.;Kotani,E.;Mori,H.固定蛋白激酶C到质型多角体上。昆虫生物技术与蚕学杂志。2010.79(1):p.1-1.)。[3]Ijiri, H., et al., Structure-based targeting of bioactive proteinsinto cypovirus polyhedra and application to immobilized cytokines for mammaliancell culture.Biomaterials, 2009.30(26):p.4297-4308.(Coulibalyb, Gento Nishimura等。基于结构的定点固定生物活性蛋白至质型多角体上并应用固定的化的细胞因子培养哺乳动物细胞培养。生物材料杂志，2009，30 (26):p.4297-4308.)。[4]曹翠平，郭爱芹等.利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察.蚕业科学，2009.35(004):p.790—795。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种多角体高效专一包裹目的蛋白的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种:将家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体基因(polyhedrin)以及目的蛋白基因分别构建至pFastBac Dual载体上的PH和PlO启动子下面，通过重组获得同时表达多角体和目的蛋白的杆状病毒。作为本专利技术的的改进:在目的蛋白基因前面加入81-90bp Hl定位信号序列以及6-12个GGS (甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)柔性连接肽。作为本专利技术的的进一步改进:该方法通过构建的重组杆状病毒在昆虫细胞sf9或甜菜夜蛾上实现目的蛋白的包装过程。作为本专利技术的的进一步改进:由Hl信号肽与柔性连接肽构成的引导基因的序列为SEQ ID N02所述。作为本专利技术的的进一步改进:Hl (信号肽)+Flexible peptide (柔性链接肽)+eGFP的序列为SEQ ID N04所述。本专利技术还同时提供了利用上述方法制备而得的病毒，所述病毒直接感染sf9或sf21细胞，在细胞内直接产生多角体包裹型的目的蛋白，每个细胞内含10-50个多角体，直径在1-2 u m，并且病毒液能继续用于感染细胞或注射甜菜夜蛾。作为本专利技术的病毒的改进:该病毒直接可以注射4-5龄甜菜夜蛾，3-5天后甜菜夜蛾发生液化，每头幼虫可以产生1-2亿个多角体包裹的目的蛋白，直径在1-2 Pm。作为本专利技术的病毒的进一步改进:所述的目的蛋白为多角体包裹型，具有生物学功能，并且为单基因编码的蛋白质。本专利技术的目的之一是提供该重组病毒的制备方法。本专利技术是按下述方案实现的:以绿色荧光蛋白eGFP作为包装的模式目的蛋白，通过全基因合成技术分别合成质型多角体蛋白polyhedrin基因、引导肽基因(含Hl信号肽+柔性连接肽)、eGFP基因(序列分别为序列表中的SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03)。本专利技术具体为通过甜菜夜蛾昆虫或者细胞实现昆虫病毒多角体对其他目的蛋白进行高效包裹，采用该方法可以大幅度提高多角体对目的蛋白的包裹效率，不仅可以在体外培养的昆虫细胞sf9和sf21内包裹，也可以在甜菜夜蛾体内大量包裹。该技术可以应用于蛋白类药物或疫苗抗原的包裹
。由于多角体这种蛋白包装材料具有很好的抗酸、耐高温等特点，所以将其用于那些具有用量小、活性高、易失活的蛋白进行包装可能对提高其稳定性以及口服给药方面会是一个突破；亚单位疫苗，一般是某种病原的一段肽或蛋白成分，直接通过口服很引起动物粘膜免疫反应，因为口服后很容易被消化系统的酶降解，所以包裹技术为亚单位疫苗直接通过口服引起动物粘膜和全身性免疫反应提供了新的途径。因此，本研究内容对于拓展蛋白类药物或亚单位疫苗在临床上的应用范围以及为今后开发更多的口服蛋白药物提供技术支持，具有重要的实际应用价值。本专利技术的专利技术点具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是：将家蚕质型多角体病毒（BmCPV）的多角体基因（polyhedrin）以及目的蛋白基因分别构建至pFastBac?Dual载体上的PH和P10启动子下面，通过重组获得同时表达多角体和目的蛋白的杆状病毒。

【技术特征摘要】
1.昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:将家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的多角体基因(polyhedrin)以及目的蛋白基因分别构建至pFastBac Dual载体上的PH和PlO启动子下面，通过重组获得同时表达多角体和目的蛋白的杆状病毒。2.根据权利要求1所述的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:在目的蛋白基因前面加入81-90bp Hl定位信号序列以及6-12个GGS(甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)柔性连接肽。3.根据权利要求2所述的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:所述方法通过构建的重组杆状病毒在昆虫细胞sf9或甜菜夜蛾上实现目的蛋白的包装过程。4.根据权利要求1、2或3所述的昆虫病毒多角体实现外源蛋白高效包裹的方法，其特征是: 由Hl信号肽与柔性连接肽构成的引导基因的序列为SEQ ID N02所述。5.根据权利要求4所述的昆虫病毒多角体实现...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁林，郭建军，杨一兵，魏国汶，
申请(专利权)人：江西省科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：