高表达外源蛋白的毕赤酵母株制造技术

本发明专利技术公开了高表达外源蛋白的毕赤酵母株，它是转染了一种毕赤酵母表达系统表达质粒，所述的表达质粒，它是由下述方法制备的：用Bspt104和Sac Ⅱ双酶切pPICZαA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg‑ 目的基因‑ccgcgg所示的基因，连接；序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C,M=A/C,S=G/C,Y=C/T，在毕赤酵母AOX启动子作用下，在报告基因EGFP起始密码子ATG前面插入6个碱基（CMSYMM），EGFP表达量提高到100‑200%。

Pichia pastoris strain with high expression of foreign protein

The present invention discloses Pichia pastoris strain for high expression of exogenous protein, which is transfected a Pichia pastoris expression plasmid, the expression plasmid, which is prepared by the following method: Bspt104 and Sac II digested pPICZ alpha and A gene sequence is shown in ttcgaaacgCMSYMMatg objective to gene ccgcgg gene, CMSYMM, sequence connection; the table including: C=C, M=A/C, S=G/C, Y=C/T in Pichia pastoris AOX promoter, insertion of 6 nucleotides in front of the EGFP reporter gene start codon ATG (CMSYMM), the expression of EGFP was increased to 100 200%.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，具体涉及在毕赤酵母AOX启动子作用下高表达外源蛋白的毕赤酵母株。
技术介绍
毕赤酵母（P.pastoris），作为一种甲醇诱导型的酵母，可以将甲醇作为唯一的使用碳源，已经成为基因工程生产外源蛋白最重要的工具，与其他表达系统而言，具有很多优点，对于大肠杆菌表达系统而言，既具有操作简单、生产成本较低、外源蛋白高产量等优点，同时还具有蛋白的翻译后加工修饰的作用；对于酿酒酵母而言，具有质粒表达的稳定性高、表达菌株较稳定、分泌效率较高等的优点；对于哺乳动物表达系统而言，具有操作简单，培养基低廉，生产过程中不易污染的特点；对于昆虫细胞表达系统而言，具有成本显著降低的优点。基因的表达调控在蛋白表达过程中发挥重要的作用，基因表达分为DNA转录成RNA和RNA翻译成蛋白质。转录是基因表达的初始阶段，在这个阶段进行调控，对于生物来说是最为经济的。真核生物中，基因调控也是主要在转录水平上进行的。通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用实现了真核生物的转录调控。生物体基因调控主要发生在这些顺式作用元件上，如启动子、GC盒、CCAAT盒、增强子、沉默子、阻遏子，最近发现起始密码子ATG周围碱基影响基因的转录效率，影响最终蛋白的产量。大量的实验结果表明起始密码子ATG周围序列对蛋白表达有不同程度的影响。Tatematsu,K.,etal.在2014年发表的文章中研究了家蚕中的起始密码子ATG周围的序列对重组蛋白表达量的影响。文章中比较了50种家蚕的自身基因，发现AAAAATCAAAATGG序列影响转录效率，之后他们利用EGFP和荧光素酶作为报告基因，构建了8种由不同的序列组成的质粒，这些序列长度为包括ATG在内的14个碱基，发现这些序列对基因转录和蛋白产量有显著影响，并且具有组织特异性。Dai,C.,etal.在2007年发表的文章中报道：他们将钾离子通道蝎毒素基因插入到pEGFP-N1真核表达载体的EGFP前面，并在融合蛋白的起始密码子ATG前插入了Kozak序列GCCACC，发现插入Kozak序列GCCACC使得融合蛋白的表达量大大升高，而未插入Kozak序列的基本上没有表达。SanoKIetal在2002年的文章中报道他们在荧光素基因以及龙虾原肌球蛋白的起始密码子ATG前面插入了龙虾原肌球蛋白cDNA的ATG前21个氨基酸，发现能显著的提高这两种蛋白的表达量。这些报道证明ATG周围序列对于基因的表达具有极大的影响，但是目前尚未有人对毕赤酵母AOX1启动子介导下ATG周围序列对基因表达的影响进行研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了提高外源基因毕赤酵母表达系统蛋白的表达量，而提供一种在毕赤酵母AOX启动子作用下，高表达外源蛋白的毕赤酵母株。一种毕赤酵母表达系统表达质粒，它是由下述方法制备的：用Bspt104和SacⅡ双酶切pPICZαA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因-ccgcgg所示的基因，连接；序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C,M=A/C,S=G/C,Y=C/T；所述的CMSYMM为：CCCGCC、CCCCCC、CCCGAA、CAGTGC、CATAGT或AACCCC；所述的基因序列为SEPIDNO.6。高表达外源蛋白的毕赤酵母株，它是转染了上述的一种毕赤酵母表达系统表达质粒。本专利技术提供了高表达外源蛋白的毕赤酵母株，它是转染了上述的一种毕赤酵母表达系统表达质粒，所述的表达质粒，它是由下述方法制备的：用Bspt104和SacⅡ双酶切pPICZαA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因-ccgcgg所示的基因，连接；序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C,M=A/C,S=G/C,Y=C/T，在毕赤酵母AOX启动子作用下，在报告基因EGFP起始密码子ATG前面插入6个碱基（CMSYMM），EGFP表达量提高到100-200%。附图说明图1EcoRⅠ和SacⅡ双酶切重组质粒pPICZαA-EGFP电泳图（1：DNAMarkerDL2000；2：酶切前的重组质粒pPICZαA-EFGP；3：酶切后的重组质粒）；图2PCR法筛选EGFP阳性转化菌株1：DNA分子标识物100bp;2-13：部分克隆酵母基因组PCR产物；图3普通视野和荧光视野下阴性（X-33）菌体的EGFP荧光检测,Scalebars:15mm；图4普通视野和荧光视野下阳性克隆的菌体的EGFP荧光检测,Scalebars:15mm；图5普通视野和荧光视野下阴性（X-33）菌体的EGFP荧光检测,Scalebars:15mm；图6普通视野和荧光视野下阳性克隆上清的EGFP荧光检测,Scalebars:15mm。具体实施方式实施例1重组质粒pPICZαA-EGFP的构建根据EGFP-pcDNA3.1质粒上EGFP基因序列（基因序列如SEPIDNO.1所示）及引物设计原则，设计引物，PCR引物中引入了酶切位点EcoRⅠ和SacⅡ。上游引物：5’-gctgaattCatggccaccatggtgagc-3’下游引物：5’-CACCGCGGctacttgtacagctcgtccatg-3’PCR反应体系为在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：将上述PCR反应得到的EGFP基因片段经过0.8%的琼脂糖凝胶电泳验证，然后将PCR片段和载体pPICZαA用EcoRⅠ和SacⅡ酶切消化，分别将消化后的质粒和PCR片段用UNIQ-10柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行胶纯化回收，琼脂糖凝胶电泳验证结果后，用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接体系为：将连接产物用热激转化法，转化到感受态DH5α大肠杆菌感受态细胞中，在LB+Zeocin平板上筛选，挑取单菌落，培养扩增后用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0试剂盒提取质粒DNA，将提取的质粒用限制性内切酶EcoRI和SacⅡ37℃过夜消化，产物取2μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳验证。如图1所示，将酶切鉴定质粒送金唯智生物科技（北京）有限公司测序，序列如SEQIDNO.2所示（序列左侧为EcoRI，右侧为SacII），最终将序列正确的菌株标记为pPICZαA-EGFP。实施例2重组质粒pPICZαA-EGFP-1的构建根据α信号肽序列和EGFP序列设计一对引物，并在上游引物中引入PstI限制性内切酶酶切位点，下游引物使用与构建pPICZαA-EGFP相同的引物。引物1：5’-GCTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACT-GCAGTTTTATTCGCAGCATC-3’引物2：5’-CACCGCGGctacttgtacagctcgtccatg-3’PCR反应体系为：在PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳验证后纯化回收，得到突变出PstI酶切位点的PCR片段，将上述反应得到的突变片段和载体pPICZαA用Bspt1041和SacⅡ消化，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳验证后，按照UNIQ-10柱式微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行胶纯化回收，琼脂糖凝胶电泳验证结果后，用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接体系为：转化大肠杆菌，在LB+Zeocin平板本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种毕赤酵母表达系统表达质粒，其特征在于，它是由下述方法制备的：用Bspt104和Sac Ⅱ双酶切pPICZαA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg‑ 目的基因‑ccgcgg所示的基因，连接，序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C,M=A/C,S=G/C,Y=C/T。

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母表达系统表达质粒，其特征在于，它是由下述方法制备的：用Bspt104和SacⅡ双酶切pPICZαA和基因序列为ttcgaaacgCMSYMMatg-目的基因-ccgcgg所示的基因，连接，序列表中所述的CMSYMM，其中：C=C,M=A/C,S=G/C,Y=C/T。2.根据权利要求1中所述的一种毕赤酵母表...

【专利技术属性】
技术研发人员：张新民，滕思莹，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22