本发明专利技术公开了细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母及构建与应用，其构建为：(1)化学合成SEQ ID No.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因的核苷酸序列；(2)利用OverlapPCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列连接得到融合序列；(3)将融合序列连接到毕赤酵母表达载体上，得到重组表达载体；(4)将重组表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。本发明专利技术可以将PET分解酶锚定到细胞表面，固定化后的酶可做全细胞催化剂，相比于野生型稳定性高、回收方便、易控制、可反复利用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶的基因工程领域，尤其涉及一种细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母及构建与应用。
技术介绍
白色污染是全球所有城市都存在的一种环境污染，主要是指人们在日常生活中随意丢弃的塑料垃圾对环境造成的破坏，包括常见的塑料杯、一次性饭盒、塑料袋等。而白色污染物的很大一部分是PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)制品。目前，世界上PET的年产量达到了2700多万吨，虽然PET不会直接对环境造成危害，但其废弃物对大气和微生物的抵抗性很强，在自然环境中的存在周期为16-48年，而且随着PET产业的快速发展，其废弃物的数量极其巨大，从环境行为和生态效应考虑，PET废弃物已成为全球性的环境污染有机物。目前降解PET的方法主要有化学降解和生物降解两大类，在实际应用中PET的化学分解法主要有水解法和醇解法，此外还有氨解、胺解和热解等。但是这些方法通常成本较高、效率较低并且不环保，避免不了降解PET后给环境带来二次污染；而生物降解方法相对化学降解工艺更简单、更节能环保、且不会造成二次污染。因此生物降解将是从根本上解决废弃PET污染的最好方法。PET分解酶是目前发现的唯一在细菌中发现的能降解PET的酶，分子量约为32KD，能将PET降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸或对苯二甲酸，其最大的优势是，与其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比，其在低温段(20～40℃)的酶活显著高于其他酶，这意味着在实际应用中较容易达到适宜的反应条件，工业应用前景较好。但是该PET分解酶对PET的分解效率不高，分离纯化困难，不利用其大规模工业化应用。参考文献：[1]ShosukeYoshida,KazumiHiraga,ToshihikoTakehana,IkuoTaniguchi，HironaoYamaji,YasuhitoMaeda,KiyotsunaToyohara,KenjiMiyamoto,YoshiharuKimura,KoheiOda.Abacteriumthatdegradesandassimilatespoly(ethyleneterephthalate)[J].science，2016(351)：1196-1199.
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有PET分解酶对PET的分解效率不高，分离纯化困难，不利用其大规模工业化应用的不足，提供一种分解效率高，分离容易的细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。本专利技术的第二个目的是提供一种细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建。本专利技术的第三个目的是提供一种细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的用途。本专利技术的技术方案概述如下：细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建，包括如下步骤：(1)化学合成SEQIDNo.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因的核苷酸序列；(2)利用OverlapPCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列连接得到融合序列；(3)将融合序列连接到毕赤酵母表达载体上，得到重组表达载体；(4)将重组表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。所述锚定蛋白基因为SEQIDNO.2所述的GCW21、SEQIDNo.3所示的GCW51或SEQIDNo.4所述GCW61。所述毕赤酵母表达载体为pPIC9。上述构建构建的细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。上述细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母在全细胞催化分解PET的用途。有益效果野生菌株产酶能力有限、生长周期长、蛋白纯化过程复杂、易变性不易保存、生产成本高，限制了其推广应用。而毕赤酵母细胞表面展示技术可以将PET分解酶锚定到细胞表面，固定化后的酶可做全细胞催化剂，相比于野生型稳定性高、回收方便、易控制、可反复利用，适合工业大规模生产应用。附图说明图1为重组毕赤酵母PETase-GCW21、PETase-GCW51、PETase-GCW51全细胞催化酶活测定与野生型比较结果图2为重组毕赤酵母细胞的免疫荧光显微照片；图2-1为重组毕赤酵母PETase-GCW21免疫荧光结果；图2-2为重组毕赤酵母PETase-GCW51免疫荧光结果；图2-3为重组毕赤酵母PETase-GCW61免疫荧光结果。具体实施方式原PET分解酶基因Genbank登录号为NZ_BBYR01000074.1。pPIC9质粒市售。下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。实施例1细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建及应用，包括如下步骤：化学合成SEQIDNo.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；根据SEQIDNo.1序列设计上游引物P-F和下游引物P-R；P-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTGP-R：5’-3’ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA进行PCR,PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，得PET分解酶基因。根据GCW21(NCBIReferenceSequence:XM_002491407)，预测其信号肽后，设计上游引物21-F和下游引物21-R；21-F：5’-3’GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGACCAGCGAATCTCTGTCAC21-R：5’-3’CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCGGCGGCAATT以毕赤酵母GS115菌株基因组DNA为模板，进行PCR，扩增得到锚定蛋白基因GCW21的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示扩增目的基因片段呈现亮带，回收目的基因片段，得GCW21基因。利用OverlapPCR将锚定蛋白GCW21基因和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列通过SEQIDNo.5所示的linker连接得到融合序列；根据锚定蛋白GCW21基因和改良过的PET分解酶基因，设计上游引物P-21/51/61-F和下游引物P-21-R；P-21/51/61-F：5’-3’CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGP-21-R：5’-3’CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG进行PCR，扩增序列如SEQIDNO.6的PETase-linker-GCW21。将PETase-linker-GCW21基因和pPIC9载体同时用XhoI和EcoRI双酶切后，将得到的PETase-linker-GCW21酶切基因片段连接到双酶切后的pPIC9载体上；将上述连接产物转化到感受态细胞E.coliDH5α中，并挑取阳性克隆，在LB液体培养基上扩增后提取质粒，得到重组表达载体p9P21。在上述步骤中，所述的目的基因片段与载体的连接采用thermo公司的T4DNA连接酶进行连接。将获得的重组表达载体p9P21转入表达宿主大肠杆菌DH5α中，扩增重组质粒。在上述步骤中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建，其特征是包括如下步骤：(1)化学合成SEQ ID No.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因的核苷酸序列；(2)利用OverlapPCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列连接得到融合序列；(3)将融合序列连接到毕赤酵母表达载体上，得到重组表达载体；(4)将重组表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。
【技术特征摘要】
1.细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母的构建，其特征是包括如下步骤：(1)化学合成SEQIDNo.1所示的改良过的PET分解酶的核苷酸序列；从毕赤酵母GS115基因组中克隆出锚定蛋白基因的核苷酸序列；(2)利用OverlapPCR将锚定蛋白基因的核苷酸序列和改良过的PET分解酶基因的核苷酸序列连接得到融合序列；(3)将融合序列连接到毕赤酵母表达载体上，得到重组表达载体；(4)将重组表达载体转入宿主毕赤酵母中，得到细胞表面展示PET分解酶的重组毕赤酵母。...
【专利技术属性】
技术研发人员：王泽方，杨海涛，王雪，童善惟，陈卓芝，程莹莹，侯宇佳，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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