本发明专利技术涉及用于医学研究领域的SV40LT抗原基因介导克氏综合征细胞模型及其细胞库的构建，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子，经感受态大肠杆菌纯化后导入经胶原酶II消化的离体传代或呈对数生长的克氏综合征细胞，使重组子与DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长、裸鼠致瘤试验、转染细胞SV40大T基因检测、mRNA产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并相同或相近于原代细胞者作为SV40LT介导克氏综合征体外研究细胞模型，为在体外从细胞水平长期研究克氏综合征的发病机制奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
重组SV40基因构建克氏综合征细胞模型及其细胞库
本专利技术涉及SV40基因(猴肾病毒40大T抗原基因或SV40LT抗原基因)重组(介导)克氏综合征细胞模型及其细胞库的构建，主要用于人类生殖健康研究领域，为克氏综合征的研究提供细胞模型并保存其科研资源。
技术介绍
克氏综合征是染色体出生缺陷之一，又称为原发性小睾丸症或曲细精管发育不良，是一种较为常见的男性性染色体异常疾病。本病的特点是染色体数目异常，多了一条X染色体。最常见的核型为47，XXY。有的患者具有两个以上的X，称为Klinefelter的变异型，如:48，XXXY、49，xXXXY，一般X越多，临床症状越严重。本病的发病率为0.1%。青春期前，一般无明显症状。青春期症状逐渐明显，外阴发育差，阴茎短小，睾丸小而硬，男性第二生发育延迟甚至不发育，皮肤细白，全身体毛发育差，阴毛、胡须稀少而腋毛经常缺如，喉结不明显，身才高，下体长于上体，近半数患者乳房发育呈女性型乳房。患者性欲低下，性功能不良，除个别患者外几乎均为无精症而不能生育。因性功能不良及不能生育等原因，且一般治疗无效，这种患者的出生，必给患者本人及家庭造成严重的心理负担和精神痛苦。 克氏综合征主要因为在精卵授精结合时，染色体不分离造成的。有文献报道，造成染色体不分离的原因与物理、化学、生物、遗传等因素有关。但是，由于没有可在体外长期培养的、可用于克氏综合征发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平在体外研究克氏综合征受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了克氏综合征的进一步研究。 国外文献报道，猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。 根据文献报道，Reilly用猿猴病毒(SV40)大T抗原基因转化来建立血管平滑肌细胞株，构建细胞模型以研究肝素对血管平滑肌的抑制作用机制。Su等利用经SV40转化的角化上皮细胞株，构建细胞模型来分析上皮细胞内蛋白质合成的调控作用。Miquel等用SV40转化的角化上皮细胞株，作为细胞模型研究层粘连蛋白5介导的细胞粘附作用。Webber等用经SV40转化的前列腺上皮细胞株作为细胞模型来研究前列腺上皮细胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用经Adl2_SV40转化肾小管上皮细胞模型来研究近曲小管的损伤和疾病。Hougton等用SV40转化建立骨髓基质细胞株作为细胞模型以研究在一定培养条件下，细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞的双向分化的潜能，进一步研究骨质疏松的机制。 因研究工作的需要，几乎每种疾病都建立了各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。 但是，至今尚未见有关构建可用于在体外从细胞水平研究克氏综合征发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关的研究项目。为了解决上述问题，本专利技术人提出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供以SV40LT抗原基因介导克氏综合征细胞模型及其细胞库的构建方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究克氏综合征的发病机制提供SV40LT抗原基因介导克氏综合征细胞模型及其细胞库。 本专利技术的目的是这样实现的:以T4DNA连接酶连接同时经BamHI酶切的pcDNA3.1 (-)DNA和PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分离的SV40LTag DNA,构建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重组质粒，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞以扩增、纯化并挑取耐氨苄青霉素的菌落抽提质粒，以脂质体转染法导入经胶原酶II消化的离体传代克氏综合征悬液组织细胞或在含20%胎牛血清、5?1nmol / L胰岛素的培养液中处于将进入或刚进入对数生长期、梭形细胞占90%以上、汇合率达55%?65%的贴壁生长克氏综合征细胞，使重组子与细胞的DNA整合，以G418筛选的含阳性重组子的细胞，作传代、扩大培养，筛选细胞形态、细胞生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长试验、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为细胞模型冻存于液氮中，以此构建SV40LT抗原基因介导克氏综合征细胞模型及其细胞库。 本专利技术以PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳提纯的SV40大T抗原基因经基因载体pcDNA3.1和脂质体转染法导入克氏综合征细胞而构建其细胞模型，其组织细胞用0.01%胶原酶II消化而不用常规的胰蛋白酶消化，以仅使引起细胞粘连的胶原被消化或使细胞悬浮，减少了细胞壁的蛋白质被消化而伤及细胞，使细胞培养的成功率由一般的约85%提高到95%以上；选用了含20mL / L胎牛血清、5?1nmol / L胰岛素的特定培养基，使细胞不会生长过快而影响SV40大T抗原基因的整合，也不会因缺少营养或细胞生长刺激因子而使细胞在未达到要求的汇合率、未进入对数生长期前就过早死亡，或对数生长期缩短；制备的细胞系在-196°C液氮中冻存I个月后复苏培养，均能生长出贴壁细胞；在作细胞系染色体鉴定时，秋水仙素的用量及作用时间是常规的5?10倍，使染色体分裂相增加，足以计数和分析；由此建成的克氏综合征细胞模型及其细胞库，为从细胞水平在体外研究克氏综合征的发病机制奠定基础。 【附图说明】 图1是本专利技术制备的克氏综合征细胞模型(贴壁生长)图。 如图1，细胞传代至第80代、培养至第10天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达95%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变得稀疏。 【具体实施方式】 1、SV40大T抗原DNA的提取:①SV40DNA酶切:从市售购买含有大T抗原基因的SV40冰冻干粉或SV40质粒，溶解于适量的H2O或TE缓冲液中，加2uL10X酶切缓冲液和18uL H20，加限制性内切酶 BamH I (I一5U / ugDNA)，37°C温育 lh，75°C加热 15min，灭活酶，加入5uL电泳加样缓冲液(也可通过加入0.5mol/LEDTA)终止反应以备电泳。②SV40DNA电泳:取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成10%琼脂糖凝胶，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，待胶凝固后从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约1mm，用适量的1X加样缓冲液制备DNA样品，然后用移液器将样品加入样品孔中，并同时做合适的DNA分子量标准对照物，接通电极，使DNA向阳极移动，在I一1V / cm凝胶的电压下电泳至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。③从琼脂糖中分离约2600bp SV40大T抗原DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于医学研究领域的重组SV40基因构建克氏综合征细胞模型及其细胞库，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamHI、pcDNA3.1(‑)DNA及SV40LTag DNA构建SV40LTag—pcDNA3.1(‑)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入经胶原酶II消化的离体传代或呈对数生长的克氏综合征组织细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT抗原基因介导克氏综合征体外研究细胞模型冻存于液氮中，为在体外从细胞水平(替代人体或动物直接试验)长期研究克氏综合征的发病机制奠定基础。
【技术特征摘要】
1.一种用于医学研究领域的重组SV40基因构建克氏综合征细胞模型及其细胞库，其主要特征是按常规以T4DNA连接酶、BamH1、pcDNA3.1㈠DNA及SV40LTag DNA构建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重组子、以感受态大肠杆菌纯化重组子、以脂质体转染法将其导入经胶原酶II消化的离体传代或呈对数生长的克氏综合征组织细胞，使重组子与细胞的DNA整合，并扩大培养经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、软琼脂集落生长、裸鼠致瘤试验、转染细胞DNA中SV40大T基因检测、mRNA表达产物测定及DNA序列测定结果符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT抗原基因介导克氏综合征体外研究细胞模型冻存于液氮中，为在体外从细胞水平(替代人体或动物直接试验)长期研究克氏综合征的发病机制奠定基础。2.根据权利要求1所述的重组SV40基因构建克氏综合征细胞模型及其细胞库，其特征是所述细胞模型为(I)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在h印ato ZYME — SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色体核型为“47，XXY”，或相同于本发明采集的原代克氏综合征细胞核型；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中整合了 SV40大T抗原基因，表达SV40大T抗原mRNA产物；(7)当细胞传代至第80代、培养至第10天时，细胞呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，汇合率达95%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏；(8)作为细胞模型用于在体外从细胞水平研究克氏综合征的发病机制、遗传资源贮存、实验对照及质控细胞。3.根据权利要求1所述的重组SV40基因构建克氏综合征细胞模型及其细胞库，其特征是取自因其他实验所需而采集的、并在其他实验后多余、废弃的克氏综合征患儿羊水脱落细胞构建之。4.根据权利要求1所述的重组SV4...
【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，黄荷凤，吕时铭，朱瑞建，王爱飞，刘蓓，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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