一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法技术

一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法，根据新冠病毒易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖以及SV40LT可使人组织细胞永生化的机制，将ACE2和SV40LT基因转染产前诊断后剩余的羊水干细胞，开发因过表达ACE2和SV40LT而易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒与孵化细胞共同培养时能随孵化细胞的无限扩增而大量繁殖，然后以所繁殖的病毒批量制备核酸检测质控病毒，继之以质控病毒取代核酸检测试剂盒配备的或有关单位使用的与被测样本不一致的假病毒或噬菌体病毒样颗粒等模拟质控物，并使用质控病毒建立基于Levey‑Jennings质控图的核酸检测室内质控方法，以便能使用真实病毒的质控物实时监测室内质控是否失控，判断同批核酸检测结果是否准确可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法
本专利技术涉及一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法，属于生物医学领域的传染病基因诊断技术。
技术介绍
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)由单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)构成。因新冠肺炎患者在下呼吸道具有更高的病毒载量，所以支气管/肺泡灌洗液的检出率相对较高，目前常以鼻咽拭子做新冠病毒的核酸检测。文献报道，采用实时荧光RT-PCR法检测新冠病毒核酸是目前诊断新冠肺炎的金标准，至今国家药品监督管理局已经批准了20多种实时荧光RT-PCR技术的新冠病毒核酸检测试剂盒，该技术灵敏、简便、低廉，能在疾病早期或潜伏期内识别微量的新冠病毒颗粒，但通常因受疾病发展阶段、样本采集质量、样本运输和保存条件、试剂和耗材质量以及实验操作技术人员水平等影响而使核酸检测结果产生假阴性或假阳性。因此，各类新冠病毒核酸检测实验室操作规范及专家共识均建议以室内质控监测核酸检测结果的准确性，但规范的室内质控需采用与被测样本相同的质控物并与被测样本在相同的条件下进行检测，即合格的室内质控物应是新冠病毒颗粒，然而这很难实现，所以只能使用被称为模拟质控物或假病毒的噬菌体病毒样颗粒替代新冠病毒颗粒进行室内质控。文献报道，目前国内外有多家生物公司研发的新冠病毒核酸检测试剂盒的室内质控品均不是以新冠病毒颗粒而是以假病毒为原料制备，而且这些质控品价格昂贵，其室内质控的监测效果还有待于用户反馈。另外，虽然基因组测序不但可以鉴定新发的未知新冠病毒株，也可用于早期低病毒含量样本的检测或实时荧光RT-PCR检测可疑结果的确认，但因缺乏可用于质量控制的阳性和阴性参考品等原因而目前仍不能适合于临床新冠样本的常规检测。文献报道，规范的室内质控应在每批检测中均设立1份弱阳性质控和3份阴性质控，室内质控应与待测样本同批次参与全检测过程，只有当3个阴性质控全部为阴性而弱阳性质控为阳性时才能视为在控，可发报告，反之则为失控，不可发出报告，应立即分析误差原因，必要时重新检测。室间质控是由卫生质管部门统一组织，将质控物分装后发放到各参与实验室进行检测，然后分析各实验室的检测结果是否准确。鉴于新冠病毒核酸检测质控物质贫乏，国内文献报道，建议自制质控品，用以取代试剂盒中配备的弱阳性对照，即以真实的新冠病毒替代假病毒。制备方法是将实验室发现的新冠病毒核酸检测阳性标本置56℃干浴灭活30min，制备2个或2个以上靶点的低值质控品，并建议用生理盐水/DEPC处理水作为阴性质控，使用时至少1份阴性质控用于环境污染的评估，即将开盖的质控品置于PCR检测的提取仪/操作台面上过夜后进行检测。综上，因目前还没有制备新冠病毒核酸检测质控品的理想方法而致质控物贫乏，无论是试剂盒中配备的阳性质控还是实验中使用的其他质控，通常以模拟质控物、假病毒或噬菌体病毒样颗粒替代新冠病毒颗粒进行质控，这难以起到预期的质量控制作用。文献报道，SARS-CoV能在血管紧张素转换酶2(ACE2)基因转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染(不含ACE2)的293T细胞中复制，SARS-CoV-2也与SARS-CoV一样，两者均通过ACE2受体感染细胞。文献还报道，人间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，其他组织细胞的传代时间更短，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)和/或人端粒酶逆转录酶(hTERT)转染的细胞系则可在体外培养350代以上。但至今未见将ACE2、SV40LT和/或hTERT转染人间充质细胞制备用于繁殖新冠病毒的永生化孵化细胞并以这种孵化细胞为载体制备新冠肺炎核酸检测质控病毒的文献报道。
技术实现思路
鉴于目前还没有制备新冠肺炎核酸检测质控物质的理想方法，本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是要公开以人造新冠病毒孵化细胞为载体的新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备方法，另一目的是要公开基于Levey-Jennings质控图的核酸检测室内质控方法。本专利技术的目的是这样实现的：(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离梭形羊水细胞或肺组织细胞，转染SV40LT和/或hTERT基因，以G418和/或嘌呤霉素筛选永生化细胞系，经细胞系生物学鉴定、肺干细胞标志物检测获得永生化羊水间充质干细胞系或肺干细胞系，命名为MSC-SV40LT/hTERT。(2)将血管紧张素转换酶II即ACE2基因连接到慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU中，分别构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G)或将重组质粒pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒，再将重组慢病毒转染MSC-SV40LT/hTERT，使ACE2整合到永生化干细胞DNA上，经过筛选和鉴定，获得易使新冠病毒感染和繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，作为制备新冠病毒灭活疫苗的基质细胞，命名为NCIC细胞(NovelCoronavirusIncubateCells)。(3)将孵化细胞分装于安瓶内，每个安瓶10×106个细胞，收藏于-196℃液氮细胞库中。(4)取细胞库中的孵化细胞，经传代培养至所需细胞量时转种到内含3-5g/L微载体的DMEM细胞培养液的生物反应器中，在37℃、5％CO2、pH值7.2、搅拌速度50±20rpm的条件下培养，使细胞在微载体表面形成60％汇合度，然后换上病毒维持液，接种0.01～0.3MOI量的新冠病毒液，在33℃、5％CO2、pH值7.4、搅拌速度50±20rpm的条件下培养48～96小时，至细胞完全病变时收获病毒液。(5)病毒液经75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、SepharoseCL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测，获得灭活病毒液。(6)将灭活病毒液配制成高值、中值、低值的质控病毒液，由参考实验室检测病毒核酸含量，确定靶值，常规分装保藏。(7)将质控病毒作为室内质控物，与被测标本在相同条件下检测，绘制Levey-Jennings质控图，建立基于Levey-Jennings质控图的新冠病毒核酸检测室内质控方法，以观察检测结果是否失控，进而判断被测标本的检测结果是否准确可靠、可否发出检测报告。(8)将质控病毒作为室间质评物，用于考核各实验室的检测质量。本专利技术的有益效果在于：因目前还没有制备新冠病毒核酸检测质控品的理想方法而致其质控物贫乏，无论是试剂盒中配备的阳性质控还是实验中另用的阳性质控，通常以模拟质控物、假病毒或噬菌体病毒样颗粒替代新冠病毒颗粒进行质控，这难以达到预期的质量控制效果。虽然有文献建议各实验室用核酸检测阳性的临床样本自制质控物，但难以使用统一标准的公认毒株制备，这同样难以达到目前核酸检测质控的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法，其特征在于，首先根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖以及SV40LT可使人类成纤维细胞永生化的机制，从产前诊断后剩余的胎儿细胞中分离干细胞，进行ACE2和SV40LT基因转染，开发出因过表达ACE2和SV40LT而易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒与孵化细胞在含有3～5g/L微载体的DMEM细胞培养液的生物反应器内并在37℃、5％CO

【技术特征摘要】
1.一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法，其特征在于，首先根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖以及SV40LT可使人类成纤维细胞永生化的机制，从产前诊断后剩余的胎儿细胞中分离干细胞，进行ACE2和SV40LT基因转染，开发出因过表达ACE2和SV40LT而易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒与孵化细胞在含有3～5g/L微载体的DMEM细胞培养液的生物反应器内并在37℃、5％CO2、pH值7.2、搅拌速度为50±20rpm的条件下共同培养时能随孵化细胞的无限扩增而大量繁殖；进而收集含有大量繁殖病毒的培养物，进行75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、SepharoseCL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测，获得灭活病毒液；继之确定待测目标核酸的靶值并根据不同核酸检测试剂盒的要求将灭活病毒液配制成高值、中值和低值的新冠肺炎核酸检测质控病毒；然后以所制质控病毒取代核酸检测试剂盒中配备的或有关单位使用的与被测样本不一致的假病毒或噬菌体病毒样颗粒等模拟质控物，或取代各单位自制的无统一批号的质控物，使各核酸检测实验室能使用与临床真实病毒一致的统一批号的质控物实时监测核酸检测质量；最后使用所述质控病毒创建基于Levey-Jennings质控图的核酸检测标准化室内质控方法，并由此实时判断同批新冠肺炎核酸检测结果是否准确可靠。


2.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法，其特征在于，所述以新冠病毒孵化细胞制备质控病毒包括以Vero细胞制备质控病毒，或以Vero细胞制备灭活病毒，进而制备核酸检测质控病毒。


3.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法，其特征在于，所述SV40LT使人类成纤维细胞永生化包括以hRERT制备永生化新冠病毒孵化细胞。


4.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法，其特征在于，所述建立新冠肺炎核酸检测室内质控方法包括将所述质控病毒配成高值、中值和低值的质控病毒，与临床样本在相同的条件下进行新冠病毒ORFlab和N基因检测，共检测20天以上，计算检测结果的循环阈值Ct/ΔCt的和SD值，进而计算和值，绘制在Levey-Jennings室内质控图上，然后继续将同批质控病毒与临床样本在相同的条件下进行新冠病毒ORFlab和N基因检测，将每天检测结果的Ct/ΔCt绘制在所述Levey-Jennings室内质控图的相应位置，假如某天质控病毒的Ct/ΔCt超过±3SD，则说明该次检测结果失控，同批临床样本核酸检测结果可能不准确，需分析原因或重新检测。


5.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)人造新冠病毒孵化细胞：
采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离梭形羊水细胞或肺组织细胞，转染SV40L...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33