一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗制造技术

一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，构建表达ACE2和半乳糖苷酶的重组载体并转化半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌，获得过表达ACE2并以半乳糖苷酶为筛选标志的基因重组嗜酸乳杆菌，以替换传统发酵菌制备乳制品，或以海藻酸钠包被成抵抗胃液的微胶囊配制乳制品，当吃乳制品或喝酸奶时，其中的嗜酸乳杆菌到达并定植于肠道，在乳糖诱导下持续表达ACE2蛋白，进而ACE2蛋白刺激宿主产生抗‑ACE2，其中ACE2蛋白能封闭冠状病毒受体结合区，抗‑ACE2能封闭宿主细胞ACE2受体，表达在益生菌体表面的ACE2能竞争吸附冠状病毒，三者共同预防病毒感染，而且ACE2有益于氨基酸吸收和保护心血管，益生菌有益于肠道微生态，是与病毒抗原、抗体无关的食品级新型疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗
本专利技术涉及一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，属于生物医学领域的传染病防治技术。
技术介绍
感染人类的冠状病毒主要包括SARS-COV(引发重症急性呼吸综合征)、MERS-COV(引发中东呼吸综合症)和SARS-CoV-2(新型冠状病毒，引发COVID-19)，其共同的特点都是通过宿主细胞的血管紧张素转换酶2(ACE2)引起感染。新型冠状病毒是冠状病毒的一种，其主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体即ACE2，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入宿主细胞引起感染。目前新冠病毒疫苗主要以S蛋白或其RBD为靶点设计开发，包括基因重组疫苗、载体疫苗(腺病毒载体或减毒流感病毒载体)和核酸疫苗(mRNA疫苗或DNA疫苗)。其作用的共同机制是使宿主产生抗新冠病毒受体结合域(S1-RBD)抗体，当这种抗体与S1-RBD结合后，新冠病毒就不能通过S1-RBD识别并结合宿主细胞表面受体(ACE2)，使之失去感染性。综上，新冠病毒的S1-RBD能与宿主细胞表面受体ACE2结合，并通过S1-RBD与ACE2结合感染宿主细胞；现有技术的新冠病毒疫苗通过刺激宿主产生抗新冠病毒S1-RBD的抗体而起免疫作用，即通过疫苗接种产生的特异性抗体与S1-RBD结合来阻断S1-RBD与宿主细胞表面受体ACE2结合，从而达到预防的目的。但未见通过疫苗接种产生的ACE2与S1-RBD结合来阻断S1-RBD与宿主细胞表面受体ACE2结合从而达到免疫预防的报道。现有疫苗接种后如果某些体质产生低滴度抗体、非中和抗体或亚中和抗体，就有产生抗体依赖性感染增强(antibodydependentenhancement，ADE)的风险，ADE指病毒感染后产生的特异性抗体对病毒感染不但没有起到抑制作用反而起促进作用。文献报道ADE是SARSCOV和MERSCOV入侵免疫细胞的重要方式，发现高浓度SARSCOV抗血清可中和SARSCOV感染，高度稀释后的抗血清则触发ADE，因SARS-COV-2与SARSCOV和MERSCOV均属于β冠状病毒，推测SARS-COV-2也可能存在ADE，而不产生上述抗体的本专利技术则没有ADE风险。现有疫苗的载体，如目前应用最广泛的人腺病毒5型(Ad5)载体，虽然其细胞毒性和免疫源性减弱、外源基因表达时效提高、可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用于靶向治疗。Ad5不与宿主细胞DNA整合，所以易被网状内皮细胞吞噬，使目的基因表达不稳定。同时由于Ad5无法复制，会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于慢性疾病的长期治疗。Ad5本质为病毒，仍具有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果，而以益生菌为载体的ACE2疫苗则没有腺病毒载体的副作用，且ACE2是一种I型跨膜糖蛋白，N端在胞膜外，通过单次跨膜锚定在细胞表面，C端在细胞膜内，对氨基酸的吸收和心血管等器官的保护均具有重要的作用。乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是定植于肠道的益生菌之一，主要包括乳球菌、嗜酸乳杆菌(乳杆菌)和双歧杆菌等。LAB能改善肠道微生态环境，具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、帮助消化、免疫调节、产生氨基酸及多种维生素等作用。嗜酸乳杆菌被作为第三代乳酸发酵菌被应用于面包、酸奶、奶酪等乳制品的生产，并具有耐酸、耐胆盐和免疫佐剂的特性，是理想的基因工程活载体疫苗的表达系统，能源源不断地表达和分泌外源目的抗原，文献报道像抗原、酶类、细胞因子、抗体、过敏原等一系列外源蛋白均可在LAB中重组表达。但LAB的抗原表达载体常带有抗生素抗性基因，使用于人或动物体内易发生抗性基因转移而带来生物安全问题，目前亦未见以抗生素抗性基因改良的嗜酸乳杆菌为载体和发酵菌种制备以口服酸奶接种的冠状病毒ACE2疫苗的报道。
技术实现思路
为了开发一种无需病毒基因、病毒抗原和病毒抗体参与的不同于现有技术的新型抗冠状病毒疫苗，本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是要提供一种以ACE2基因重组酸奶益生菌表达的ACE2蛋白及其诱导的ACE2抗体预防新冠病毒感染的ACE2疫苗及其制备方法和用途。本专利技术的目的通过以下技术方案实施：构建能同时过表达ACE2基因和半乳糖苷酶(LacF)基因的重组载体(ACE2-LacF-pPlac)并转染LacF缺陷型嗜酸乳杆菌，获得过表达ACE2并以LacF为筛选标志的基因重组ACE2-LacF双表达嗜酸乳杆菌，进而将该重组菌包被成抵抗胃液作用的微胶囊，然后将该重组菌或其微胶囊替换现有技术的发酵菌，配制乳制品，口服后释放的重组益生菌定植于肠道繁殖，在乳糖诱导下持续表达抗新冠病毒的ACE2蛋白。首先，构建半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌：敲除嗜酸乳杆菌中的LacF基因，构建以非抗生素抗性基因(LacF)为筛选标记的LacF缺陷型嗜酸乳杆菌，其方法包括将嗜酸乳杆菌中LacF基因的PCR扩增产物连接到克隆载体PMD-19T，构建重组子PMD-19T-LacF，然后将该重组子中包含LacF两端同源重组序列(LacF1、LacF2)和PMD-19T序列的PCR扩增产物连接至载体PUC-19，构建重组子LacF1-PMD-19T-LacF2-PUC-19，将该重组子与经感受态菌转化、质粒提取、PCR扩增和酶切的移码突变体LacF(ΔLacF)的PCR扩增产物进行酶切、连接，使ΔLacF序列替换PMD-19T，实现LacF无义序列的替换，然后将经过T-A克隆、酶切的ΔLacF亚克隆到敲除载体PBR322，构建PBR322-ΔLacF，经鉴定后电转化至嗜酸乳杆菌，进行同源重组，使突变序列(ΔLacF)整合到菌体的染色体上，替换掉靶基因LaeF，然后筛选出不分解乳糖的LacF缺陷型嗜酸乳杆菌(LacF-突变株)，并行Southern鉴定。进而，构建半乳糖苷酶互补型质粒(pPlac-LacF)：以乳酸菌质粒(pNZ9530)为模板，扩增其复制子(RepA-RepC)和nisin的启动子(Pnis)，并合成MCS多克隆位点，将RepA-RepC、Pnis和MCS连接至载体PMD-19-T，同时将从重组子PMD-19T-LacF扩增的LacF基因克隆至载体PMD-19-T，构建以非抗生素抗性基因LacF为选择标记的食品级半乳糖苷酶互补型质粒(LacF-pPlac)，并转化上述构建的LacF缺陷型嗜酸乳杆菌，筛选能使LacF-突变株恢复乳糖利用能力的半乳糖苷酶互补型质粒(LacF-pPlac)。进而，构建ACE2-LacF双表达半乳糖苷酶互补型质粒：设计引物，加酶切序列，扩增含有酶切位点的ACE2基因，将AC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，以ACE2基因重组益生菌表达的ACE2蛋白及其诱导的抗-ACE2预防冠状病毒感染，包括构建表达ACE2基因的重组载体并转化食品级酸奶益生菌，筛选表达ACE2基因的益生菌株，包被成微胶囊，配制于乳制品，使食用后的益生菌定植于靶组织繁殖并持续表达ACE2蛋白，随后ACE2蛋白刺激宿主产生抗-ACE2，其中ACE2蛋白起封闭冠状病毒受体结合区S1-RBD的作用，抗-ACE2起封闭宿主细胞表面冠状病毒受体ACE2的作用，表达在益生菌表面的ACE2可与宿主细胞竞争吸附冠状病毒，从而阻断冠状病毒通过S1-RBD与ACE2受体的结合感染宿主。/n

【技术特征摘要】
1.一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，以ACE2基因重组益生菌表达的ACE2蛋白及其诱导的抗-ACE2预防冠状病毒感染，包括构建表达ACE2基因的重组载体并转化食品级酸奶益生菌，筛选表达ACE2基因的益生菌株，包被成微胶囊，配制于乳制品，使食用后的益生菌定植于靶组织繁殖并持续表达ACE2蛋白，随后ACE2蛋白刺激宿主产生抗-ACE2，其中ACE2蛋白起封闭冠状病毒受体结合区S1-RBD的作用，抗-ACE2起封闭宿主细胞表面冠状病毒受体ACE2的作用，表达在益生菌表面的ACE2可与宿主细胞竞争吸附冠状病毒，从而阻断冠状病毒通过S1-RBD与ACE2受体的结合感染宿主。


2.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，所述载体包括用于递送ACE2基因的干细胞、干细胞系、纳米粒、人工载体；所述益生菌包括乳球菌、粪链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、拉曼乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌Ty21a血清型变异株。


3.根据权利要求1、2所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，所述益生菌是指以非抗生素抗性基因为筛选标志的半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌。


4.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，所述表达ACE2基因的重组载体是指克隆了复制子、启动子、多克隆位点、ACE2基因和半乳糖苷酶基因的ACE2-LacF双表达半乳糖苷酶互补型质粒。


5.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，所述益生菌株是指以半乳糖苷酶为筛选标志并表达ACE2基因的嗜酸乳杆菌。


6.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，所述包被成微胶囊是指将ACE2-LacF双表达嗜酸乳杆菌和W/V为3.0％CaCl2、0.4％海藻酸钠、12.5％微孔淀粉、0.1％Tween-80配制的混合液制成微胶囊。


7.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒ACE2疫苗，其特征在于，所述载体或质粒包括pNZ8148、pLEISS、pMG36e、pBBR1MCS-5、pBBR1MCS-6、pRV610、pLEM415、pHY300PLK、NZ9000、MG1363、pBARGPE1、pNZ8149、pAN7-1、pBHt1、pVE5523、pPG611.1、pPG612.1、pMA5、pHCMC05、pGFP22、pGFP315、pHP13、pHP13-43、pHY-43、pWB980、pAOX1、MG1363、pNZ8148、NZ9000、pNZ9530、pMG36e、pKLAC1、GG799、pYD1、EBY100、pYES2、pYES2-flag、pYES2NTA、NTB、NTC、pYES3CT、pYIP5、pYRP7、pADH2、pRSH41、pDC315、pDF15、pUG6、pESC-His、BFD14、BFD15、pDNR1、p334、pDR195、pRS316，pRS316HA、YEplac112、YCplac33、YEplac195、YEpLac181、YIP211、pYX212、pYX212-VHB、pPG1或pPG2。


8.根据权利要求1所述的一种以酸奶益生菌为载体的冠状病毒A...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33