一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法技术

一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，将ACE2、S1‑RBD和/或IL‑10基因连接胞壁锚定基因或分泌型基因，然后克隆至以半乳糖苷酶为筛选标志的质粒、胞外锚定质粒或分泌型质粒，构建重组质粒，转化半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌，获得能在胞内、胞壁或胞外定位表达ACE2、RBD和/或IL‑10融合蛋白的以半乳糖苷酶筛选的重组益生菌，以海藻酸钠包被成抵抗胃液的微胶囊，配制成发酵酸奶，口服后重组菌定植于肠道持续表达外源基因，其中表达的ACE2蛋白能封闭病毒RBD并有利于氨基酸吸收和心血管，IL‑10起抗炎作用；产生的抗‑ACE2能封闭ACE2受体，抗‑RBD能封闭病毒RBD，阻断病毒通过RBD与ACE2受体结合感染；重组菌有维持肠道微生态、提高免疫力、产生多种维生素等益生作用。

【技术实现步骤摘要】
一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法
本专利技术涉及一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，属于生物医学领域的传染病防治技术。
技术介绍
感染人类的冠状病毒主要包括SARS-COV、MERS-COV和SARS-CoV-2，都通过宿主细胞的血管紧张素转换酶2(ACE2)引起感染。如SARS-CoV-2(新型冠状病毒)，其主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，通过其S蛋白的受体结合域S1-RBD识别、结合宿主细胞表面受体ACE2，引起感染。目前新冠病毒疫苗主要以S蛋白或其RBD为靶点设计开发，包括基因重组疫苗、载体疫苗(腺病毒载体或减毒流感病毒载体)和核酸疫苗(mRNA疫苗或DNA疫苗)。其作用的共同机制是使宿主产生抗新冠病毒受体结合域(S1-RBD)抗体，当这种抗体与S1-RBD结合后，新冠病毒就不能通过S1-RBD识别并结合宿主细胞表面受体(ACE2)，所以就失去了感染性。综上，新冠病毒的S1-RBD能与宿主细胞表面受体ACE2结合，并通过S1-RBD与ACE2结合感染宿主细胞；现有技术的新冠病毒疫苗通过刺激宿主产生抗新冠病毒S1-RBD的抗体而起免疫作用，即通过疫苗接种产生的特异性抗体与S1-RBD结合来阻断S1-RBD与宿主细胞表面受体ACE2结合，从而达到预防的目的。但未见通过疫苗接种产生的ACE2与S1-RBD结合来阻断S1-RBD与宿主细胞表面受体ACE2结合从而达到免疫预防的ACE2疫苗报道。现有疫苗如果接种后某些体质产生低滴度抗体、非中和抗体或亚中和抗体，就有产生抗体依赖性感染增强(antibodydependentenhancement，ADE)的风险，ADE指病毒感染后产生的特异性抗体对病毒感染不但没有起到抑制作用反而起促进作用。文献报道ADE是SARSCOV和MERSCOV入侵免疫细胞的重要方式，发现高浓度SARSCOV抗血清可中和SARSCOV感染，高度稀释后的抗血清则触发ADE，因SARS-COV-2与SARSCOV和MERSCOV均属于β冠状病毒，推测SARS-COV-2也可能存在ADE，而不产生上述抗体的ACE2疫苗则没有ADE风险。现有疫苗的载体，如目前应用最广泛的人腺病毒5型(Ad5)载体，虽然其细胞毒性和免疫源性减弱、外源基因表达时效提高、可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用于靶向治疗。Ad5不与宿主细胞DNA整合，所以易被网状内皮细胞吞噬，使目的基因表达不稳定。同时由于Ad5无法复制，会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于慢性疾病的长期治疗。Ad5本质为病毒，仍具有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果，而以益生菌为载体的ACE2疫苗则没有腺病毒载体的副作用，且ACE2是一种I型跨膜糖蛋白，N端在胞膜外，通过单次跨膜锚定在细胞表面，C端在细胞膜内，对氨基酸的吸收和心血管等器官的保护均具有重要的作用。乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是定植于人和动物肠道的益生菌之一，主要包括乳球菌、嗜酸乳杆菌(乳杆菌)和双歧杆菌等。LAB能改善肠道微生态环境，具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、帮助消化、免疫调节、产生氨基酸及多种维生素等作用。嗜酸乳杆菌被称为第三代乳酸发酵菌被应用于面包、酸奶、奶酪等乳制品的生产，并具有耐酸、耐胆盐和免疫佐剂的特性，是理想的基因工程活载体疫苗的表达系统，能源源不断地表达和分泌外源目的抗原，文献报道像抗原、酶类、细胞因子、抗体、过敏原等一系列外源蛋白均可在LAB中重组表达。但LAB的抗原表达载体常带有抗生素抗性基因，使用于人或动物体内易发生抗生素抗性基因转移而带来生物安全问题，目前亦未见以抗生素抗性基因改良的嗜酸乳杆菌为基因载体或发酵菌种制备预防冠状病毒感染的益生酸奶的文献报道。
技术实现思路
为了开发一种以喝酸奶预防冠状病毒感染的益生酸奶，本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是要提供一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，这种益生酸奶中含有抗生素抗性基因改良的ACE2基因重组益生菌，这种重组益生菌具有发酵酸奶、免疫佐剂和益生作用，特别是这种重组益生菌能表达ACE2蛋白并由ACE2蛋白刺激宿主产生ACE2抗体，使冠状病毒的S1-RBD不能与ACE2受体结合而预防冠状病毒感染；另一目的是要提供一种含有能表达S1-RBD基因和/或IL-10基因的基因重组益生菌的益生酸奶及制备方法。本专利技术的目的通过以下技术方案实施：构建能同时过表达ACE2基因和半乳糖苷酶(LacF)基因的重组载体(ACE2-LacF-pPlac)，并转染LacF缺陷型嗜酸乳杆菌，获得过表达ACE2基因的以LacF为筛选标志的ACE2-LacF双表达基因重组嗜酸乳杆菌，或将S1-RBD基因和/或IL-10基因取代ACE2基因，同理构建过表达S1-RBD基因和/或IL-10基因的基因重组嗜酸乳杆菌，然后将该重组菌包被成抵抗胃液作用的微胶囊，进而将重组菌或其微胶囊替换现有技术的发酵菌，配制乳制品，口服后释放的重组益生菌定植于肠道，在乳糖诱导下表达抗新冠病毒感染的ACE2蛋白，或S1-RBD蛋白、IL-10因子。首先，构建半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌：敲除嗜酸乳杆菌中的LacF基因，构建以非抗生素抗性基因(LacF)为筛选标记的LacF缺陷型嗜酸乳杆菌，其方法包括将嗜酸乳杆菌中LacF基因的PCR扩增产物连接到克隆载体PMD-19T，构建重组子PMD-19T-LacF，然后将该重组子中包含LacF两端同源重组序列(LacF1、LacF2)和PMD-19T序列的PCR扩增产物连接至载体PUC-19，构建重组子LacF1-PMD-19T-LacF2-PUC-19，将该重组子与经感受态菌转化、质粒提取、PCR扩增和酶切的移码突变体LacF(ΔLacF)的PCR扩增产物进行酶切、连接，使ΔLacF序列替换PMD-19T，实现LacF无义序列的替换，然后将经过T-A克隆、酶切的ΔLacF亚克隆到敲除载体PBR322，构建PBR322-ΔLacF，经鉴定后电转化至嗜酸乳杆菌，进行同源重组，使突变序列(ΔLacF)整合到菌体的染色体上，替换掉靶基因LaeF，然后筛选出不分解乳糖的LacF缺陷型嗜酸乳杆菌(LacF-突变株)，并行Southern鉴定。进而，构建半乳糖苷酶互补型质粒(pPlac-LacF)：以乳酸菌质粒(pNZ9530)为模板，扩增其复制子(RepA-RepC)和nisin的启动子(Pnis)，并合成MCS多克隆位点，将RepA-RepC、Pnis和MCS连接至载体PMD-19-T，同时将从重组子PMD-19T-LacF扩增的LacF基因克隆至载体PMD-19-T，构建以非抗生素抗性基因LacF为选择标记的食品级半乳糖苷酶互补型质粒(LacF-pPlac)，并转化上述构建的LacF缺陷型嗜酸乳杆菌，筛选能使LacF-突变株恢复乳糖利用能力的半乳糖苷酶互补本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，其特征在于，包括：(1)敲除益生发酵菌嗜酸乳杆菌的半乳糖苷酶基因，构建以半乳糖苷酶为筛选标记的半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌突变株；(2)将乳酸菌质粒的复制子、启动子、半乳糖苷酶基因以及合成的多克隆位点克隆至基因载体，构建半乳糖苷酶互补型载体；(3)根据GenBank人ACE2 mRNA序列设计引物，添加酶切位点，经PCR扩增获得ACE2基因，进而经酶切和连接将ACE2基因克隆至半乳糖苷酶互补型载体，获得同时表达ACE2基因和半乳糖苷酶基因的重组载体；(4)将所述重组载体转化突变株，获得双表达ACE2和半乳糖苷酶的无抗生素抗性基因的重组嗜酸乳杆菌；(5)将重组嗜酸乳杆菌包被成抵抗胃液的微胶囊；(6)以重组嗜酸乳杆菌或重组嗜酸乳杆菌微胶囊替代现有技术的嗜酸乳杆菌发酵菌，配制抗冠状病毒感染的发酵乳制品；(7)食用发酵乳制品后，其中的重组嗜酸乳杆菌定植于肠道繁殖，并持续表达ACE2蛋白，随后ACE2蛋白刺激宿主产生抗-ACE2，其中ACE2蛋白起封闭冠状病毒受体结合区S1-RBD的作用，抗-ACE2起封闭宿主细胞表面冠状病毒受体ACE2的作用，表达在益生菌表面的ACE2可与宿主细胞竞争吸附冠状病毒，从而阻断冠状病毒通过S1-RBD与ACE2受体的结合而感染宿主。/n...

【技术特征摘要】
1.一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，其特征在于，包括：(1)敲除益生发酵菌嗜酸乳杆菌的半乳糖苷酶基因，构建以半乳糖苷酶为筛选标记的半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌突变株；(2)将乳酸菌质粒的复制子、启动子、半乳糖苷酶基因以及合成的多克隆位点克隆至基因载体，构建半乳糖苷酶互补型载体；(3)根据GenBank人ACE2mRNA序列设计引物，添加酶切位点，经PCR扩增获得ACE2基因，进而经酶切和连接将ACE2基因克隆至半乳糖苷酶互补型载体，获得同时表达ACE2基因和半乳糖苷酶基因的重组载体；(4)将所述重组载体转化突变株，获得双表达ACE2和半乳糖苷酶的无抗生素抗性基因的重组嗜酸乳杆菌；(5)将重组嗜酸乳杆菌包被成抵抗胃液的微胶囊；(6)以重组嗜酸乳杆菌或重组嗜酸乳杆菌微胶囊替代现有技术的嗜酸乳杆菌发酵菌，配制抗冠状病毒感染的发酵乳制品；(7)食用发酵乳制品后，其中的重组嗜酸乳杆菌定植于肠道繁殖，并持续表达ACE2蛋白，随后ACE2蛋白刺激宿主产生抗-ACE2，其中ACE2蛋白起封闭冠状病毒受体结合区S1-RBD的作用，抗-ACE2起封闭宿主细胞表面冠状病毒受体ACE2的作用，表达在益生菌表面的ACE2可与宿主细胞竞争吸附冠状病毒，从而阻断冠状病毒通过S1-RBD与ACE2受体的结合而感染宿主。


2.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，其特征在于，所述益生发酵菌包括乳球菌、粪链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、拉曼乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、沙门氏菌、伤寒沙门氏菌Ty21a血清型变异株。


3.根据权利要求1、2所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，其特征在于，所述益生发酵菌或载体菌是指嗜酸乳杆菌。


4.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，其特征在于，所述载体包括细胞载体、纳米载体、人工载体、pNZ8148、pLEISS、pMG36e、pBBR1MCS-5、pBBR1MCS-6、pRV610、pLEM415、pHY300PLK、NZ9000、MG1363、pBARGPE1、pNZ8149、pAN7-1、pBHt1、pVE5523、pPG611.1、pPG612.1、pMA5、pHCMC05、pGFP22、pGFP315、pHP13、pHP13-43、pHY-43、pWB980、pAOX1、MG1363、pNZ8148、NZ9000、pNZ9530、pMG36e、pKLAC1、GG799、pYD1、EBY100、pYES2、pYES2-flag、pYES2NTA、NTB、NTC、pYES3CT、pYIP5、pYRP7、pADH2、pRSH41、pDC315、pDF15、pUG6、pESC-His、BFD14、BFD15、pDNR1、p334、pDR195、pRS316，pRS316HA、YEplac112、YCplac33、YEplac195、YEpLac181、YIP211、pYX212、pYX212-VHB、pPG1或pPG2。


5.根据权利要求1、4所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，其特征在于，所述载体是指PMD-19-T、PUC-19、PBR322或pPlac。


6.根据权利要求1所述的一种预防冠状病毒感染的益生酸奶及制备方法，其特征在于，所述乳制品包括酸奶、胶囊、片剂、粉剂、口服液、保健品。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33