一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞制造技术

一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，以新冠病毒易感基因ACE2敲除、新冠病毒靶向干扰基因shRNA重组、SV40LT和/或hTERT永生化基因转染等方法将原本弃用的产前诊断后剩余羊水细胞以及新生儿出生后的脐血、脐带、胎盘等组织细胞改造为兼具干细胞固有治疗功能、人工改造的新冠病毒RNA干扰功能、无限传代的永生化功能以及新冠病毒感染受体缺失特性的可再生利用的基因沉默干细胞，专用于个体化治疗COVID

【技术实现步骤摘要】
一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞


[0001]本专利技术涉及一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，属于生物医学领域的传染病防治技术。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS
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CoV
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2的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N 端的结构域(S1
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NTD)和受体结合域(S1
‑
RBD)组成，S1
‑
RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。
[0003]目前的新冠病毒疫苗主要以S蛋白或其RBD为靶点设计开发。在新冠病毒载体疫苗的制备中，人腺病毒5型(Ad5)是应用最广泛的病毒载体。人腺病毒含有26
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45kb的双链线性 DNA基因组，基因组中含有4个早期转录基因区(E1
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E4)和1个晚期转录基因区，两端各有 1段约100bp的反向未端重复序列(ITR)。第一代腺病毒载体删除了E1和E3区基因，第二代腺病毒载体删除了E1
‑
E4区基因，Ad5为第三代腺病毒载体，删除了所有病毒编码基因，仅保留5
’
和3
’
端ITR及包装信号，可容纳36kb外源基因。虽然Ad5的细胞毒性和免疫源性减弱，外源基因表达时效提高，可感染的细胞多而应用广，但易引起非特异性感染而不适用于靶向治疗，临床应用中易产生副作用。Ad5不与宿主细胞DNA整合，虽较安全但使目的基因表达不稳定，进入宿主细胞后易被网状内皮细胞吞噬而失去作用。同时由于Ad5无法复制，会使体内重组病毒越来越少，所以不适用于临床慢性疾病的长期治疗。Ad5本质为病毒，仍具有免疫源性和细胞毒性，宿主对病毒载体的免疫应答会干扰对目的抗原的免疫应答，大多数正常人已受过腺病毒感染，对病毒载体的预存免疫也会干扰疫苗的免疫效果。
[0004]目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞 (NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NF
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κB等信号通路来治疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以基因功能改造的干细胞治疗 COVID
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19以及取代腺病毒载体制备新冠病毒载体疫苗的文献报道。
[0005]通常间充质干细胞在体外传代至15
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30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。这为干细胞体外培养寿命的改良和产业化扩增提供了依据。文献报道，SARS
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CoV能在
ACE2 转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染的293T细胞中复制。目前报道SARS
‑
CoV
‑
2也通过ACE2受体感染宿主细胞，所以本专利技术拟将干细胞中的ACE2基因敲除。
[0006]RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶 (Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶的作用下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割成大量的次级siRNA，进而形成RISC而发挥作用，使RNAi的作用进一步放大，最终将外源靶mRNA完全降解。但尚未见以人工构建的具有RNA干扰功能的干细胞治疗COVID
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19以及取代腺病毒载体制备新冠病毒载体疫苗的文献报道。

技术实现思路

[0007]基于目前用于治疗COVID
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19的干细胞的问题，本专利技术人提出了本专利技术。
[0008]本专利技术的目的是以敲除干细胞的新冠病毒易感基因hACE2、给干细胞装配新冠病毒RNA 干扰基因shRNA以及将永生化基因hTERT和/或SV40LT转染干细胞的方法，建立一种兼具干细胞固有治疗功能、人工改造的新冠病毒RNA干扰功能、无限传代的永生化功能以及新冠病毒感染受体缺失特性的基因沉默干细胞，专用于个体化治疗COVID
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19。
[0009]本专利技术的目的通过以下技术方案实施：
[0010]首先，获得间充质干细胞。例如，从产前诊断后剩余的样本中分离羊水成纤维细胞，制备所需的干细胞；或从干细胞样本库中获得间充质干细胞，诱导所需的干细胞。
[0011]进而，给干细胞装配永生化基因。例如，构建携带hTERT和/或SV40LT的重组载体，转染干细胞，使干细胞DNA整合上hTERT和/或SV40LT基因，从而获得能永久生存、无限传代的新功能，可再经鉴定或诱导获得干细胞或肺干细胞系。
[0012]进而，敲除干细胞的hACE2基因。例如，从GenBank检索人ACE2核酸序列，下载其FASTA 文件，进入www.genome
‑
engeering.org，上传文件并筛选出评分较高的单导向RNA(sgRNA) 序列，在每条sgRNA序列F链5
’
端添加CACC序列，R链5
’
端添加AAAC序列，与pX330质粒经Fast Diget Bbs I酶切后的粘性末端形成互补，合成sgRNA寡链核苷酸(oligo)序列，以 T4连接酶将双链sgRNA与pX330载体进行连接，然后转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，其特征在于，以干细胞分离、诱导、SV40LT和/或hTERT基因转染的方法将产前诊断后剩余的羊水细胞制备成永生化干细胞，然后通过构建CRISPR
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Cas9质粒pX330
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ACE2敲除永生化干细胞的新冠病毒易感基因ACE2，制备ACE2基因敲除的永生化干细胞，进而将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA敲入ACE2基因敲除的永生化干细胞，制备能在体外无限传代、新冠病毒感染受体ACE2缺失、能够靶向干扰新冠病毒在干细胞内复制的专用于COVID
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19个体化治疗的基因沉默干细胞。2.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，其特征在于，所述基因沉默干细胞，包括敲除新冠病毒易感基因hACE2的干细胞和/或永生化干细胞、敲入新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA的干细胞和/或永生化干细胞，或在同一干细胞中同时敲除新冠病毒易感基因hACE2、敲入新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰基因shRNA和转染永生化基因SV40LT和/或hTERT的干细胞。3.根据权利要求1、2所述的一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，其特征在于，所述干细胞包括成体和胚胎干细胞、间充质干细胞、肺干细胞、诱导的干细胞或肺干细胞。4.根据权利要求1、2或3任一所述的一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，其特征在于，所述基因沉默干细胞经重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒的包装、慢病毒转染、基因沉默干细胞的筛选和鉴定。5.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA和/或新冠病毒易感基因ACE2的互补双链克隆到慢病毒载体的多克隆位点。6.根据权利要求1所述的一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。7.根据权利要求1、6所述的一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞，其特征在于，扩增所述hACE2基因的上游引物为：CMV
‑
F：5
’‑
CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
‑
3；下游引物为：EF1
‑
Rn：5
’‑
GCCAGTACACGACATCACTT
‑3’
；β
‑
actin的上游和下游引物分别为：5
’‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：